Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Тонкослойная хроматография аминокислот
Методы разделения
Тонкослойная хроматография (ТСХ) — простейший и наиболее доступный метод разделения аминокислот, по возможности количественной оценки результатов этим методом весьма ограниченны. Идентификация индивидуальных пятен может быть сделана только тщательным сравнением хроматограмм, полученных для стандартных аминокислот, разделенных в идентичных условиях параллельно (в то же самое время). Описаны методы приготовления пластинок со слоем силикагеля и целлюлозы и условия разделения аминокислот двумерной хроматографией [44]. Ряд фирм выпускает пластинки для тонкослойной хроматографии, дающие воспроизводимые результаты.
1. Описано разделение 24 аминокислот, в том числе лейцина и изолейцина, на пластинках 200x200 мм, покрытых слоем целлюлозы MN-300 (фирма Macherey Nagel and Со.) толщиной 100 мкм [190]. Общее время анализа 6 ч.
Растворитель для первого направления: пропан-2-ол-муравьиная кислота — вода (40:2:10); для второго направления; трет-бутанол — мстиэтилкетон — 0,88 NH3 — вода (50:30:10:10).
2. Предложена улучшенная система растворителей, позволяющая разделить 40 аминокислот и родственных соединений на целлюлозных пластинках MN-300 без связующего агента [147]. Растворитель для первого направления: пропан2-ол — 2-бутаион — 1 М НСl (60:15:25), для второго направления: 2-метил-пропанол — 2-бутанон — пропанон — метанол — вода — 0,88 NH3 (40:20:20:1:14:5). Пластинки перед употреблением промывают от загрязнений. Камера должна быть насыщена каждым из компонентов смеси растворителей. После прохождения в первом направлении высушивают пластинку 15 мин холодным воздухом, затем 15 мин при 60 °С для удаления следов НСl перед хроматографией во втором направлении. Время прохождения растворителей в каждом направлении 2,5 ч. На рис. 8.3 схематически показаны результаты разделения смеси 24 аминокислот.
Та же система растворителей была использована для разделения 76 N-содержащих метаболитов, найденных в биологических жидкостях; идентификация осуществлялась с помощью селективно окрашивающих реагентов [149] (разд. 8.14).
3. Тонкослойные пластинки Avicel (фирма Analtech) исследованы для одно- и двумерного разделения аминокислот в 6 системах растворителей. Приведены значения Rf для 35 аминокислот. В препаративных экспериментах использовалась нагрузка до 0,05 М вещества [87].
4. Разделение 19 аминокислот проведено па тонкослойных пластинках с обращенной фазой, в том числе с C18, химически связанной с силикагелем [338].
5. Представляет интерес разделение 24 аминокислот на вольфрамате олова, однако этот метод не дает никаких преимуществ по сравнению с другими методами [272].