Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Реагенты и растворители
В автоматическом анализе последовательности наиболее дорогостоящая статья эксплуатационных расходов приходится на реактивы. На обеспечение ими каждого секвенатора в течение одного года требуется ~15 000 долл. США. В печати и в лабораториях все время дискутируется вопрос об источниках снабжения реактивами. Мнения сильно расходятся; одни утверждают, что необходимо окончательную очистку всех реактивов проводить потребителем [1, 11], другие предлагают производить закупку наиболее дешевых коммерческих партий с последующим их испытанием каждым потребителем. Мнение большинства находится где-то между этими двумя крайними точками зрения. В нашей лаборатории используются несколько разных источников снабжения, и наша стратегия заключается в следующем.
Мы покупаем все реактивы у фирмы Beckman. Из всех доступных ранее «секвенаторных» реактивов продукция этой фирмы — самая дорогая, но реактивы только этой фирмы имеют гарантию проверки на секвенаторе. Поскольку каждый из реактивов по отдельности проверен на секвенаторе и все реактивы имеют наименьшие изменения качества от партии к партии, то при работе с ними меньше всего шансов на неудачи в анализе структуры.
Однако их высокая стоимость толкнула многих (в том числе и нас) на поиск других источников снабжения. В целом наш опыт говорит о том, что реактивы фирмы Pierce хорошего, но непостоянного качества, ключевым реагентом является ГФМК и, по нашему мнению, большая часть описанных в литературе изменений постадийных выходов возникает именно из-за непостоянства качества ГМФК. Доказано, что коммерческие препараты «безводной» ГМФК содержат воду, описана методика дальнейшей осушки кислоты [1]. По нашему мнению, в целом это бесполезно, и мы не обнаружили особых преимуществ при снижении содержания воды с 30 до 4—6 млн-1.
Значительная экономия достигается при покупке растворителей не у фирмы Beckman, а у других фирм. У нас никогда не возникало никаких затруднений при использовании бензола из разных источников, хотя нашим постоянным поставщиком является фирма Burdick and Jackson. Некоторые проблемы могут быть связаны с применением разных партий этилацетата, так как многие партии этого растворителя содержат примеси, разрушающие ФТГ-производные аминокислот.
Мы рекомендуем простой тест для этилацетата. Надо взять стандартное количество ФТГ-производных аминокислот (мы обычно используем наши стандарты, предназначенные для ГЖХ или для ВЭЖХ), смешать их с 1,5 мл этилацетата из испытуемой партии и оставить при комнатной температуре на 30 мин, затем высушить в потоке азота. Остаток затем анализировать количественно методом-ГЖХ или ВЭЖХ, измеряя высоты ликов. Растворение в этилацетате либо не влияет на высоту пиков ФТГ- производных аминокислот, либо разрушает эти производные полностью, и в результате не обнаруживается никаких пиков.
Изредка попадались партии растворителя, дававшие промежуточные результаты. При проведении этого простого теста как для относительно дешевого этилацетата (Burdick and Jackson), так и для умеренно дорогого (Pierce) получены хорошие результаты.
Добавление различных протекторов в реагенты и растворители в последние годы практикуется реже, чем ранее (например, внесение соляной и аскорбиновой кислот). Не так часто, как ранее, применяется добавление восстановителей в хлоробутан, особенно если для анализа производных Ser и Thr используется метод ВЭЖХ*.
Для очистки реактивов необходимо иметь перегонные аппараты. Дистилляционные установки с вращающейся мешалкой стоят около 4000— 30 000 долл. США (B/R Instrument Соrр.).
* Добавление дитиотреита во все реагенты и растворители, используемые на стадиях отщепления тиазолинонов и превращения последних в ФТГ, в настоящее время считается обязательным для проведения высокочувствительного анализа. — Прим. перев.