Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение С-концевой последовательности аминокислот
Выделение и идентификация С-концевых пептидов
Методики ионообменной хроматографии

Для выделения и идентификации С-концевых областей белков и пептидов предложено несколько методик. Все эти методики обеспечивают избирательное отделение С-концевого пептида от всех других пептидов методами ВЭЖХ, ионообменной хроматографии, двумерного высоковольтного электрофореза или специфического связывания ТФ-носителями.

Маловероятно, чтобы описанные ниже методики получили широкое распространение; к ним будут обращаться в особых случаях. Предпринималась попытка локализовать С-концевой пептид ß-галактозидазы путем трипсинолиза малеилированного (для расщепления только по остаткам Arg) белка, последующего малеилирования смеси пептидов и пропускания ее через дауэкс-50 при pH 3—4 [100]. При этом полагалось, что все пептиды, за исключением С-концевого, заряжены положительно (благодаря наличию остатков Arg) и поэтому должны задерживаться на колонке (связываться с ионообменной смолой); один лишь незаряженный С-концевой пептид проходит через колонку без задержки. На практике этот подход оказался неудачным, так как С-концевой пептид ß-галактозидазы при кислых значениях pH нерастворим. Этот метод неприменим к белкам, имеющим С-концевой Arg или содержащим в составе С-концевого пептида последовательность Arg-Pro или остаток His.

С-Концевые пептиды A-цепи инсулина, лизоцима, цитохрома с, трипсина выделяли после блокирования всех свободных карбоксильных групп глициламидом при помощи водорастворимого карбодиимида (1 -этил-3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид, ЭДК) и расщепления полипептидов трипсином [33]. Все триптические пептиды, за исключением блокированного С-концевого, содержали свободные карбоксильные группы и присоединялись к анионообменной смоле AG-1-X2 (фирма Biorad). Перед хроматографией гидролизат обрабатывали карбоксипептидазой В, так как положительно заряженные Arg-содержащие пептиды не связывались со смолой и элюировались вместе с С-концевым пептидом. Свободный Arg отделяли от С-концевого пептида гель-фильтрацией или катионообменной хроматографией. Несмотря на то что эта многостадийная методика представляется продолжительной, ее рекомендуют как простую и довольно быструю.