Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Определение С-концевой последовательности аминокислот
Введение
К. У. УАРД (С. W. WARD, Division of Protein Chemistry, CSIRO, Parkville, 3052 Victoria, Australia)
В то время как главные достижения в структурном анализе белка обязаны методу N-концевого отщепления аминокислот по Эдману, а применение автоматических секвенаторов позволило определить протяженные (40—70 остатков) последовательности аминокислот, структурный анализ белков с С-конца до сих пор находится в неудовлетворительном состоянии. Несмотря на бесспорную необходимость решения этой проблемы и большие усилия в этом направлении, ощутимых успехов пока не достигнуто.
Установление последовательности с С-конца требуется при определении структуры пептидов и белков в тех случаях, когда в изучаемых объектах N-концевая аминокислота блокирована уже в исходном природном материале (формильной, ацетильной или пироглутамильной группой) или в результате химических реакций, протекающих при расщеплении белка или фракционирования полипептидов; к таким реакциям относятся карбамоилирование [85], циклизация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту [8], образование иминотиазолинона при расщеплении по остатку цианоцистеина [20, 40], образование циклического амида из N-концевого S-карбоксиамидометил- или S-карбоксиметилцистеина [80], О→N-ацильная миграция с гидроксильных функций N-концевых Ser и Thr [81], перегруппировка аспарагинилглициновых последовательностей [10,43].
Надежные методы С-концевого анализа необходимы не только для определения ограниченных последовательностей аминокислот отдельных пептидов. Для широкого применения быстрых методов определения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, все чаще и сильнее ощущается потребность в знании как N-, так и С-концевых последовательностей соответствующих белков. Такие данные необходимы для правильного расположения инициирующего кодона и считывающей рамки; для того чтобы разобраться в проблемах перекрывающейся экспрессии различных генных продуктов, считываемых с одной и той же последовательности нуклеиновых кислот в пределах одной и той же или же разных рамок считывания [5, 24], а также для того, чтобы определить, произошла ли протеолитическая модификация больших молекул предшественников. Объем необходимой информации о последовательности аминокислот белка зависит от типа нуклеиновой кислоты, структура которой определяется (мРНК или геномная ДНК). Если исходным материалом для анализа последовательности является мРНК, то достаточно ограниченной информации о N- и С-концевой последовательностях белка, так как кодирующая последовательность транслируемой области мРНК при считывании точно соответствует аминокислотной последовательности белка [56]. Однако при получении последовательности нуклеотидов геномной ДНК может потребоваться значительно больше данных о структуре белка, так как последовательность оснований, кодирующих конечный белок, может быть не беспрерывной, но включать большие участки нетранслируемой последовательности (интроны), которые затем проявляются на уровне мРНК [6, 16, 24, 52, 73].
В этой статье сделан обзор методик целенаправленного выделения С-концевых пептидов, которые затем можно изучать обычными методами N- и С-концевого анализа последовательности и(или) методом определения только одной С-концевой аминокислоты. В то время как методы преимущественного выделения С-концевых пептидов и идентификации С-концевых остатков развиты достаточно хорошо, методы прямого анализа С-концевой последовательности аминокислот практически вообще отсутствуют и в настоящее время не существует методик, обеспечивающих высокие постадийные выходы, определение протяженных последовательностей и сравнимых по эффективности с результатами N-концевого анализа по Эдману.