Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
y-Карбоксиглутаминовая кислота
Методы анализа
8.12.2.1. Тонкослойная хроматография. На алюминиевых пластинках со слоем целлюлозы 0,1 мм (фирма Merck) в системе н-бутанол — муравьиная кислота — вода (75:15:10) Gla дает фиолетовое пятно при окрашивании нингидрином с Rf 0,24. Описан колориметрический метод определения Gla с ацетальдегидом и нитропруссидом [260].
8.12.2.2. Аминокислотный анализатор.
Катионнообменная колонка. Время выхода Gla с колонки сильно зависит от pH первого буфера. На анализаторе Beckman 121 М при pH нитратного буфера 2,68 времена элюирования составляли 13,0, 17,4 и 30,5 мин соответственно для Суа, таурина и Gla. Другие аминокислоты элюировались позднее. Расчетный коэффициент по нингидрину для Gla составляет 39% от коэффициента для Glu [145]. В буфере pH 3,25 Gla плохо разрешается с пироглутаминовой кислотой. Для их идентификации собирают фракцию элюата и берут две параллельные пробы: первую для щелочного (2,5 М NaOH, 105 °С, 24 ч), вторую для кислотного (6 М HCI, аналогичные условия) гидролиза. Пироглутаминовая кислота в обоих случаях полностью гидролизуется до глутаминовой кислоты. Концентрацию Gla находят из разницы между количеством глутаминовой кислоты, образовавшейся при кислотном и щелочном гидролизах. В качестве внутреннего стандарта при количественном определении используют [14С] цистеиновую кислоту. Суммарный выход Gla в виде Glu составляет 95—98% [179].
Анионообменная колонка. С анионообменной колонки Gla элюируется после всех аминокислот. Так, с колонки (125X9,0 мм, фирма Bio-Rad) с носителем Aminex А-27 или А-28, уравновешенной 0,3 М натрийацетатным буфером (pH 4,6), при элюировании тем же буфером (скорость потока 70 мл/ч, 30 °С) Gla элюировалась на 55-й минуте [361]. Аналогичные результаты были получены в работе [182].
8.12.2.3. ВЭЖХ [206].
Предколоночная модификация. Смешивают 50 мкл гидролизата белка или мочи с 50 мкл ОФА-рeагента (разд. 8.16.3.2) и энергично перемешивают. Через 2 мин добавляют 100 мкл 0,1 М KH2PO4в 66%-ном ацетонитриле. 2—20 мкл приготовленного раствора вносят на колонку.
ВЭЖХ. Используют короткую колонку (50X4,6 мм), упакованную Nucleosil 5SB (размер частиц 5 мкм; фирма Macherey-Nagel). Это сильный анионообменник на основе силикагеля с N(СН3)3-функциональными группами. Элюируют в изократическом режиме при 47 °С (скорость потока 2 мл/мин), в качестве подвижной фазы служит 0,2 М натрийцитратный буфер (pH 5,28) — ацетонитрил (1:1). Повторные анализы могут быть проведены в тех же условиях без регенерации колонки. Детектирование осущeставляют при длине волны возбуждающего света 240 нм и эмиссии при 418 им с обрезающим фильтром. Большинство аминокислот элюируются вместе в течение двух минут, затем сходят с колонки Glu, Asp, Суа, S-карбоксиметилцистеин и, наконец, Gla (на 7-й минуте). Соотношение площадь пика: количество Gla линейно меняется в диапазоне 0,3—100 пмоль.
Замечание. Недавно производное Gla с ОФА было определено методом ВЭЖХ с использованием ß-карбоксиаспарагиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта [143].