Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
y-Карбоксиглутаминовая кислота
Гидролиз белка
Впервые у-карбоксиглутаминовая кислота Gla была обнаружена в протромбине, позже — в других белках и моче; для ее количественного определения были предложены различные методы: аминокислотный, анализ [134, 145, 146, 179, 182, 234, 361], ГЖХ [247], колориметрический анализ (в интервале 0,5∙10:5х10-4 моль/л) [290] и ВЭЖХ [205, 206].
Gla полностью декарбоксилируется в условиях кислотного (1 М НСl, 100 °С, 16 ч, вакуум) и щелочного гидролиза, используемого для белков [205]. Пептиды, содержащие остатки Gla, могут быть обнаружены с помощью так называемого «теплового диагонального» метода. Пептидная смесь подвергается электрофорезу на бумаге при pH 6,5. Бумагу высушивают нагреванием до 80 °С в течение 1 ч и затем проводят электрофорез при pH 6,5 во втором направлении. Декарбоксилированные пептиды сдвигаются при этом с диагонали [235] (а также H. Morris, частное сообщение).
1. Гидролизуют белок в 2,5 М КОН при 100 °С (16 ч, вакуум или N2). Центрифугируют. Охлаждают супернатант в ледяной бане и подкисляют до pH 4—5 добавлением по каплям сначала 60%-ной, а затем 6%-ной НСlO4. Оставляют во льду на 30 мин. Центрифугируют для удаления осадка КСlO4. Для анализа используют 2—10 мкл супернатанта [205].
2. Гидролизуют белок в 0,4—1,0 мл 2,0 М КОН при 110 °С в течение 22 ч. Добавляют 0,2 мл свежеприготовленного насыщенного раствора КНСО3. При перемешивании нейтрализуют 70%-ной НСlO4 до pH 7 (по индикаторной бумаге). Центрифугируют и прозрачный супернатант анализируют. Gla стабильна при pH 7 (—20 °С) [145].