Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Трипсин

Одним из наиболее доступных высокоспецифичных ферментов, получивших широкое применение, является трипсин. Препараты трипсина получают из различных источников, однако иногда в них присутствует примесь химотрипсина. В этом случае следы химотрипсина ингибируют с помощью L-(1-тозиламидо-2-фенил)этилхлорометилкетона (ТФК) [57]. Рекомендуется использовать трипсин, обработанный ТФК, выпускаемый фирмой Worthington.

3.5.1.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Трипсин специфически гидролизует пептидные связи по карбоксильной группе лизина и аргинина, т. е. типа -Lys-X- и -Arg-X-. Однако специфичность фермента не абсолютна, например фрагменты -Lys-Pro- и -Arg-Pro- устойчивы к действию трипсина. Присутствие кислотных остатков вблизи атакуемой связи приводит к резкому снижению скорости гидролиза, а в некоторых случаях полностью его исключает. Положительно заряженные группы также снижают скорость гидролиза. Например, если Arg и Lys находятся в ближайшем соседстве или расположены на N-конце полипептидной цепи, происходит лишь частичное расщепление пептидных связей.

В литературе приводится ряд примеров неспецифического действия трипсина, хотя такие случаи встречаются крайне редко. Чувствительными к действию фермента могут быть пептидные связи, расположенные вблизи ароматических или гидрофобных аминокислотных остатков. Показано, что такой тип гидролиза не связан с примесью химотрипсина, а является свойством самого трипсина или присутствующего в виде примеси ψ-трипсина [52]. В ряде случаев наблюдается расщепление связей -Arg-Pro-, например во фрагментах -Trp-Arg-Pro-Ala- [74] и -Ala-Arg-Pro-Ala- [35]. Число полученных пептидов может не соответствовать общему количеству остатков аргинина и лизина (плюс один). Можно получить пептиды с остатком лизина или аргинина, расположенным не в С-концевом участке пептида. Однако такие случаи чрезвычайно редки. Таким образом, при интерпретации полученных результатов следует избегать поспешных выводов.

Условия гидролиза. Трипсин — это сериновая протеаза, обладающая максимальной активностью в диапазоне pH 7—9. Фермент обратимо инактивируется при рН<4. С целью предотвращения автолиза трипсин растворяют в 10 мМ НСl, после чего образец можно хранить в замороженном состоянии в течение нескольких недель. Гидролиз трипсином проводят в 0,1 М аммонийбикарбонатном буфере при соотношении фермент : субстрат=1 : 50-:-100 при 37°С в течение 1—4 ч. Гидролиз можно ограничить, используя в качестве субстрата нативный белок или снижая температуру и продолжительность инкубации. Так, например, при 25 °С в течение 30 мин в тропонине С наблюдается расщепление только 6 из 15 связей, чувствительных к трипсину [58].

Активность трипсина падает в денатурирующих условиях, например в присутствии 4 М мочевины сохраняется лишь 48% активности [39]. Удовлетворительные результаты получены при гидролизе трипсином в 2 М гуанидин-НСl [101]. Фермент необратимо инактивируется в присутствии ДФФ и ФМСФ. Известен также ряд специфических ингибиторов, например ингибитор из сои [4]. который образует с трипсином стехиометрический комплекс и часто используется для остановки реакции [58]. При этом рекомендуется добавлять в реакционную смесь 4 мг ингибитора на 1 мг фермента. Гидролиз можно остановить подкислением; однако инактивация обратима, и при повышении pH активность фермента восстанавливается.

Специфическое расщепление по остаткам аргинина. Специфичность трипсина можно ограничить благодаря обратимому блокированию остатков лизина (разд. 3.4.3). В этом случае гидролиз проходит только по остаткам аргинина. Наиболее распространена модификация цитраконилированием; если продолжительность гидролиза трипсином слишком велика, используют малеилирование. Деблокирование малеильных или цитраконильных групп проводят подкислением реакционной смеси до рН<3,5, а затем осуществляют разделение полученных пептидов. При подкислении фермент инактивируется, однако для предотвращения его активации при последующем повышении pH, рекомендуется отделять его от продуктов реакции или инактивировать необратимо. Если с модифицированными пептидами предполагается работать в кислой среде, то в пептид рекомендуется вводить трифтороацетильные группы.

Специфическое расщепление по остаткам лизина. При необходимости провести гидролиз белка только по остаткам лизина используют обратимую модификацию по остаткам аргинина [75] (разд. 3.4.4). Полученные пептиды фракционируют при низких pH, а затем снимают защитные группировки. При использовании этого метода получают воспроизводимые результаты [5, 122], однако в отдельных случаях после модификации наблюдается снижение растворимости белка, в особенности после лиофильного высушивания.

Специфическое расщепление по остаткам цистеина. Алкилирование остатков цистеина этиленимином приводит к получению аналога лизина — S-аминоэтилцистеина [81], и, таким образом, возникают дополнительные участки, чувствительные к действию трипсина. Скорость гидролиза по остаткам аминоэтилцистеина значительно ниже по сравнению с гидролизом по остаткам лизина и аргинина [12, 78]. При условии модификации остатков лизина и аргинина гидролиз трипсином проходит избирательно по остаткам цистеина. При этом стадия модификации остатков лизина и аргинина должна предшествовать восстановлению и последующему аминоэтилированию. Напротив, в случае цитраконилирования предварительно модифицируют сульфгидрильные группы белка. Кислотная природа защитных групп лизина и объемные боковые цепи модифицированных остатков аргинина препятствуют расщеплению трипсином, если один из этих остатков находится вблизи остатка аминоэтилцистеина.

Специфическое расщепление по остаткам аспарагиновой кислоты. Метод модификации карбоксильных групп диаминами [112] позволяет проводить гидролиз белка избирательно по остаткам аспарагиновой кислоты. При этом происходит модификация С-концевой и карбоксильных групп глутаминовой кислоты. В связи с этим маловероятно, что метод найдет практическое применение для гидролиза белков. Однако метод вполне применим для гидролиза коротких пептидов, содержащих ограниченное количество или вообще не содержащих глутаминовой кислоты.