Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Тромбин
Одним из наиболее специфичных и доступных ферментов является тромбин, и достойно удивления, что он до сих пор не нашел практического применения. По-видимому, ограниченный интерес к ферменту объясняется тем, что различные партии препарата варьируют по степени очистки и активности. Тромбин выпускается рядом фирм: Calbiochem, Miles Lab., Sigma. Описан метод дополнительной очистки коммерческого препарата тромбина на СП-сефадексе G-50 [106]. Подробное описание методов определения активности и идентификации различных молекулярных форм тромбина приведено в работе [64].
3.5.2.1. Специфичность и условия гидролиза.
Специфичность. Гидролиз тромбином проходит по С-концевой пептидной связи остатков аргинина типа -Arg-X-. В нативном субстрате фибриногене этой связью является -Arg-Gly-, в других белках в качестве остатка X может быть аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистеин, валин [64]. Наблюдается также гидролиз по связи -Arg-His- в кальмодулине [108]. Обработка тромбином приводит к расщеплению только очень ограниченного числа пептидных связей аргинина, и, следовательно, этот метод можно считать идеальным для получения крупных фрагментов белка, предназначенных для автоматического секвенирования. В некоторых случаях тромбин даже в жестких условиях гидролизует в белке только одну пептидную связь, в других случаях степень гидролиза зависит от продолжительности реакции и температуры. Соответствующие примеры приведены в работе [106].
Условия гидролиза. Тромбин — сериновая протеаза; проявляет максимум активности при pH 8,0. Гидролиз проводят в условиях, аналогичных трипсину, т. е. в 100 мМ NH4HCO3при 37 °С в течение 4—8 ч, но два последних параметра могут варьировать в широких пределах. Активность тромбина определяют по степени свертывания фибриногена в условных единицах NIH (введенных National Institutes of Health, США) [64]. Соотношение фермент : субстрат также варьирует в широком диапазоне: от 1 : 100 до 1 : 5 [46, 70] и от 1 до 60 ед./мг субстрата [59, 118]. В связи с этим в каждом конкретном случае следует подбирать оптимальные условия гидролиза, например, осуществляя контроль за процессом гидролиза с помощью электрофореза. Соответствующие примеры приведены в работе [71]. Тромбин ингибируется ДФФ и ФМСФ.