Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Протеаза V8 из Staphylococcus aureus

Протеазу V8 выделяют из штамма V8 S. aureus [43]; она поставляется как коммерческий препарат фирмой Miles, ферменты с аналогичной специфичностью выделены из штамма 8325N St. aureus [83] и из сорго [28, 29], но они не выпускаются в виде коммерческих препаратов.

Специфичность. Фермент проявляет специфичность в основном к С-концевой пептидной связи глутаминовой кислоты типа -Glu-X-, где в качестве X может быть любой аминокислотный остаток, кроме пролина и глутаминовой кислоты. Показано, что субстратная специфичность зависит от состава буферных растворов [17]. Так, например, в 50 мМ ацетате аммония (pH 4,0) или 50 мМ NH₄HCO₃(pH 7,8) фермент характеризуется высокой специфичностью, в то время как в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,8) происходит гидролиз по остаткам глутаминовой и аспарагиновой кислот. По другим данным [3], в фосфатном буфере иногда наблюдается увеличение скорости гидролиза. Различие в специфичности можно объяснить тем, что скорость гидролиза по остаткам аспарагиновой кислоты в фосфатном буфере значительно выше, чем в ацетатном или бикарбонатном буферах. Известно также, что связи, соседние с S-карбоксиметил-цистеином не чувствительны к действию фермента [119].

Особого внимания заслуживают работы, посвященные изучению протеазы V8 [21—23, 107]. Согласно литературным данным, при обработке протеазой V8 иногда наблюдается неспецифический гидролиз ряда связей, главным образом связи -Ser-X-. Однако в большинстве случаев протеаза V8 селективно гидролизует пептидные связи остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот [116]. Иногда наблюдается только частичный гидролиз чувствительных к действию фермента связей, особенно если в коротком фрагменте содержится несколько остатков глутаминовой кислоты.

Условия гидролиза. Протеаза V8 сохраняет активность в диапазоне pH 3,5—9,5 [17], причем максимальная активность наблюдается при pH 4,0 и 7,8 [43]. Эта сериновая протеаза ингибируется ДФФ. Фермент активен в 0,2%-ном ДСН и сохраняет 50% активности в 4M мочевине [17]. Таким образом, гидролиз протеазой можно проводить в денатурирующих условиях, когда необходимо солюбилизировать субстрат. В литературе нет прямых доказательств того, что связывание ДСН с субстратом влияет на активность фермента. Гидролиз проводят в 50 мМ ацетате аммония (pH 4,0) при 37 °С, причем продолжительность гидролиза может достигать 18 ч [43]. Однако в зависимости от требуемой специфичности фермента гидролиз осуществляют при pH 7,8 в 50 мМ NH₄HCO₃или 50 мМ натрийфосфатном буфере.