Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Клострипаин

Сульфгидрильная протеаза клострипаин выделена из Clostridium histolyticum [68]. Подробную информацию об использовании этого фермента можно найти в работе [67]. Фермент выпускается в виде коммерческого препарата фирмами Worthington и Boehringer. Сравнительно недавно предложен метод дополнительной очистки этих препаратов методом аффинной хроматографии на w-аминоалкилагарозе (сефароза-С₇NН₂) [31]. Метод позволяет получить высокоактивный препарат, немного отличающийся от известного ранее. Перед употреблением рекомендуется подвергать коммерческий препарат клострипаина дополнительной очистке с помощью указанного метода.

8.5.4.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. В основном специфичность клострипаина сводится к гидролизу С-концевой пептидной связи по остаткам аргинина (связь типа -Arg-X-), хотя иногда наблюдается гидролиз отдельных связей -Lys-X-. Степень гидролиза по остаткам лизина можно ограничить, варьируя условия. Так, например, были найдены условия гидролиза 20-членного фрагмента лизоцима по двум остаткам аргинина, при сохранении пептидной связи остатка лизина [93], а также β₂-гликопротеина I человека [61] по остаткам аргинина и отдельным остаткам лизина. Описан [103] гидролиз фрагмента дигидрофолатредуктазы (полученного при расщеплении белка под действием BrCN) по остаткам аргинина с сохранением пептидной связи остатков лизина. Выход пептидов, полученных в результате гидролиза по остаткам аргинина, составляет 40—100%. Аналогичные результаты получены при гидролизе фрагмента фосфоглицераткиназы лошади (полученного при расщеплении белка под действием BrCN). В этом случае клострипаин гидролизует фрагмент белка по трем остаткам аргинина, не затрагивая пяти пептидных связей остатков лизина. Специфичность препарата клострипаина, дополнительно очищенного методом аффинной хроматографии, исследована на примере парвальбумина хека, содержащего один остаток аргинина и 12 остатков лизина. Инкубация белка при 37 °С в течение 12 ч приводит к гидролизу по остатку аргинина. Имеются данные [19, 69], что фермент проявляет аналогичную специфичность в отношении других объектов. Таким образом, специфичность клострипаина аналогична действию трипсина на белки с модифицированными остатками лизина. На практике метод гидролиза клострипаином обладает определенными преимуществами, поскольку при этом исключаются стадии модификации и деблокирования остатков лизина.

Условия гидролиза. Клострипаин проявляет максимум активности при pH 7,7 в присутствии сульфгидрильных реагентов [68]. Целесообразно проводить гидролиз в присутствии ионов Са²⁺, хотя их присутствие не обязательно. Гидролиз проводят при соотношении фермент : субстрат = 1 : 50 в 100 мМ NH₄HCO₃ и 1 мМ дитиотреите при 25 °С в течение 4 ч. Рекомендуется предварительно активировать фермент в 10 мМ ДТТ и 20 мМ NH₄HCO₃ в течение 1 ч, а затем инкубировать раствор белка при соотношении фермент : субстрат= 1 : 200 в 50 мМ NH₄HCO₃ при 37 °С в течение 12 ч [31]. Температуру раствора и продолжительность гидролиза варьируют в зависимости от поставленных задач. С целью солюбилизации субстрата в некоторых случаях в реакционную смесь добавляют 2 М мочевину [93].