Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Традиционная стратегия определения структуры белков
Методики
Окрашивание пептидов

Высушенный после электрофореза или хроматографии лист бумаги исследуют в ультрафиолетовом свете для локализации флуоресцентных пятен (окисленные остатки триптофана). Пептиды затем проявляют обработкой флуорескамином [74] и/или реагентом нингидрин — ацетат кадмия [28].

Окрашивание флуорескамином делает возможным последующее препаративное элюирование пептидов с двумерных карт на бумаге и позволяет контролировать правильность вырезания полос после одномерного разделения (обычно хроматографией в БУВП). Проявление нингидрином (боковой полосы) уступает по чувствительности флуорескамину и иногда не обнаруживает пептидов с N-концевыми остатками Ilе и Val, но оно более достоверно, поскольку интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству пептида. В отличие от флуорескамина нингидрин окрашивает пептиды с N-концевыми остатками пролина. С помощью этого реагента можно до известной степени даже дифференцировать N-концевые аминокислотные остатки по образующемуся цвету пятна: красному для большинства аминокислот, желтому для Glу и Ser и оранжевому, переходящему постепенно в красный, для Asn и Суа. Совместное применение флуорескамина, нингидрина и цветных реакций на определенные аминокислоты помогает точно локализовать пептид в сложных смесях при одномерном разделении.

10.8.3.1. Окрашивание флуорескамином. Флуорескамин хранят в виде раствора в безводном ацетоне с концентрацией 0,1 мг/мл. Перед употреблением 1 мл этого раствора добавляют к 100 мл 1%-ного (об./об.) пиридина в ацетоне. Бумагу погружают в раствор и затем высушивают в потоке теплого (или комнатной температуры) воздуха. Если после осмотра хроматограммы под ультрафиолетовой лампой не появились флуоресцирующие пятна, процедуру повторяют, увеличив концентрацию флуорескамина (2 мл исходного раствора на 100 мл пиридина).

10.2.3.2. Окрашивание реагентом нингидрин — ацетат кадмия. Нингидрин хранят в виде 0,25%-ного (масс./об) раствора в ацетоне, а ацетат кадмия — в водной уксусной кислоте (1 г Cd(CH₃CОО)₂∙2H₂О — 50 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл воды). Бумагу погружают в смесь, приготовленную из 100 мл раствора нингидрина и 15 мл раствора ацетата кадмия, сушат при комнатной температуре и затем нагревают при 100 °С в течение 3 мин. После проявления окраски оставляют хроматограмму на ночь под тягой для развития окраски и проявления медленно реагирующих пептидов.