Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Традиционная стратегия определения структуры белков
Методики
Препаративные электрофорез и хроматография на бумаге
Разделение относительно простой смеси пептидов, такой, например, как объединенная фракция кислых пептидов с ДЭАЭ-целлюлозы, может быть осуществлено однократной хроматографией на бумаге. Для фракционирования более сложных смесей («хвостовые» фракции с колонки с сефадексом G-50) может потребоваться применение нескольких методов, последовательность которых лучше всего выбирать после проведения аналитического электрофореза при pH 6,5 с последующим фракционированием нейтральной полосы при pH 2,1. Сложная смесь нейтральных пептидов, как правило, лучше разделяется в условиях хроматографии в системе БУВП, тем не менее часто предпочитают электрофорез из-за большей компактности образующихся полос. Кроме того, примеси, элюирующиеся с бумаги после хроматографии в БУВП, могут катализировать деструкцию остатков тирозина во время кислотного гидролиза пептида (во избежание которой добавляют 0,1% фенола к 6 М НСl) и препятствовать полноте протекания реакции дансилирования (для удаления примесей пептиды экстрагируются бутилацетатом). Эти осложнения можно устранить, применяя хроматографию на первой стадии разделения. Заключительную стадию очистки пептида рекомендуется проводить на бумаге ватман № 1, поскольку уровень свободных аминокислот на ней ниже, чем на бумаге ватман 3 ММ.
Таблица 10.6. Маркеры для электрофореза
|
Маркеры |
Способ приготовления |
|
Ксилолцианол FF и оранжевый G (красители) |
Растворяют 500 мг красителя в 10 мл воды |
|
Дансил-Arg-Arg, дансил-Arg и дансиловая кислота (флуорохромы) |
Растворяют 17,4 мг аргинина и 47,4 мг аргинил-аргинина в 10 мл 0,5 М NаНСО3; добавляют 80 мг дансилхлорида в 10 мл ацетона и инкубируют в запаянной пробирке 2 ч при 37 °С; храпят при 4 °С |
|
Смесь аминокислот |
Готовят смесь следующих аминокислот (по 1 мг): Суа, Leu, Phe, Pro, Tyr, Val, Arg, Lys; 2) Asp, Glu, Ala, Gly, Ile, Ser, Thr, His; каждый набор аминокислот доводят до 1 мл раствором 1 мМ НСl; раствор хранят при 4 °С |
Пептиды растворяют в буфере pH 6,5 (табл, 10,4) и наносят вдоль линии старта (полосой). Нерастворимые пептиды после высушивания растворяют в небольшом объеме 98%-ной муравьиной или уксусной кислоты, затем разбавляют водой до 50%-ной концентрации и наносят на бумагу. В процессе нанесения раствор высушивают теплым воздухом (с помощью фена), при этом надо соблюдать осторожность, поскольку при перегревании возможно окисление остатков метионина, приводящее к образованию нескольких форм одного пептида (с разными значениями Rfпри хроматографии). При электрофорезе между образцами пептидов наносят флуоресцентные маркеры (табл. 10.6), а в углы листа бумаги — красители. Полезно использовать в качестве «свидетелей» смесь аминокислот, особенно если для проявления электрофореграммы используется окрашивание нингидрином. В хроматографии маркером служит положение фронта растворителя.
10.8.2.1. Одномерное разделение. Смесь нескольких пептидов (каждого < 1 мкмоль) растворяют в 0,5 мл буфера (pH 6,5) и наносят в виде полосы 15 см на лист бумаги ватман № 1. Опрыскивают электрофореграмму флуорескамином и окрашивают боковую полосу нингидрином.
10.8.2.2. Двумерное разделение. Смесь пептидов (каждого <1 мкмоль) растворяют в 1 мл буфера (pH 6,5) и наносят в виде полосы в 15 см на бумагу ватман 3 ММ. Проведя электрофорез или хроматографию в первом направлении, опрыскивают флуорескамином, боковую полосу бумаги окрашивают нингидрином и фенантренхиноном. Вырезают пептидные и промежуточные полосы и «пришивают» их к бумаге ватман № 1. Промежуточные полосы также анализируют, поскольку они могут содержать уникальные пептиды, образовавшиеся с низким выходом, которые замаскированы другими пептидами в основной полосе.
Проводят электрофорез во втором направлении и проявляют электрофореграмму. Если в первом направлении использовалась хроматография, то перед электрофорезом во втором направлении широкие пептидные полосы можно сконцентрировать осторожным смачиванием листа бумаги.
Если в смеси находится <500 нмоль каждого пептида, то ее растворяют в 0,5 мл буфера (pH 6.5) и наносят на бумагу ватман 3 ММ полосой в 5 см. Дальнейшие процедуры аналогичны вышеописанным.
10.8.2.3. Двумерное разделение, дополненное трехмерным разделением нейтральных пептидов. Смесь пептидов (каждого <500 нмоль) растворяют в 0,5 мл буфера (pH 6,5), наносят полосой в 5 см на бумагу ватман 3 ММ. После электрофореза при pH 6,5 вырезают полосу нейтральных пептидов, «подшивают» ее к листу бумаги ватман 3 ММ и хроматографируют в системе БУВП. Вновь вырезают с хроматограммы нейтральную полосу, «пришивают» ее к листу бумаги ватман № 1 и проводят заключительный электрофорез. Полосы кислых и основных пептидов «подшивают» к бумаге ватман № 1 для электрофореза во втором направлении.