Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Традиционная стратегия определения структуры белков
Реконструкция полипептидной цепи

Для установления общей последовательности белка пептиды одного типа гидролиза должны быть «перекрыты» пептидами, полученными из другого гидролизата. Некоторые комбинации протеолитических фрагментов, такие, как трипсин и химотрипсин или трипсин и стафилококковая протеаза, хорошо дополняют друг друга в этом отношении, в то время как комбинация трипсин+ протеаза из A. mellea или химиотрипсин + пепсин менее выгодны, поскольку они образуют значительное число фрагментов, отличающихся только на один аминокислотный остаток (табл. 10.1). Нет необходимости определять полную структурy всех пептидов второго набора, обычно ограничиваются получением таких характеристик, как аминокислотный состав, N-кoнцевые аминокислоты, электрофоретическая подвижность, но, безусловно, должна быть установлена аминокислотная последовательность «перекрывающих» областей и тех участков цепи, корректность структуры которых вызывает сомнение. Перекрывающая последовательность должна захватывать по крайней мере два С-концевых остатка одного пептида и два N-концевых другого. Если установление структуры белка не завершено в значительной степени, то более короткие перекрывающие последовательности, чем указанные, должны быть подтверждены дополнительными данными. Если же структура установлена почти полностью, то вероятность конкурирующей последовательности для «неубедительного» перекрытия снижается и пептиды могут быть ориентировочно размещены по цепи. Стратегия и выбора рациональной схемы фракционирования пептидов. Например, по данным аминокислотного анализа белок содержит 15 остатков аргинина, однако при фракционировании триптического гидролизата на двумерной карте после обработки фенантренхиноном [80] обнаружено только 5 флуоресцентных пятен. Это свидетельствует или о том, что в нерастворимом коре остались нерасщепленными 10 остатков аргинина, или о том, что при гидролизе образовалось 10 крупных нерастворимых пептидов которые задержались на старте. Одна пептидная карта может быть последовательно окрашена флуорескамином [7, 74] фенантренхиноном (остатки аргинина) [80] и, наконец, реагентом Паули (остатки гистидина и тирозина) [17]. Если белок предварительно окислен надмуравьиной кислотой, то триптофансодержащие пептиды обнаруживаются по флуоресценции при осмотре хроматограммы под ультрафиолетовой лампой до опрыскивания флуорескамином (разд. 8.14).

Оптимальные условия для разделения растворимых пептидов конкретного белка могут быть определены только экспериментально. Однако чаще всего и успешно используется следующая последовательность операций: электрофорез при pH 6,5, а затем хроматография в БУВП с последующим разделением полосы нейтральных пептидов при pH 2,1 или 3,5 [7]. Гидролизуют 10—20 нмоль белка, лиофилизуют для удаления солей. Растворяют в небольшом объеме 98%-ной муравьиной кислоты, разбавляют до 50%-ной концентрации и наносят в виде полосы шириной 1 см иа бумагу ватман 3 ММ для электрофореза при pH 6,5 (табл. 10.4). Полосу нейтральных пептидов вырезают и подшивают к старту листа бумаги ватман 3 ММ для хроматографии в системе БУВП. Подобным же образом поступают с полосами кислых и основных пептидов. После хроматографии вновь вырезают нейтральную полосу и подшивают ее к листу бумаги ватман 3 ММ для заключительного электрофореза при pH 2,1 или 3,5.

Аналитические пептидные карты служат также для контроля процесса элюирования пептидов с колонки и последующего объединения фракций. Для этого небольшие порции (5 нмоль пептида) чередующихся фракций высушивают досуха, вновь растворяют в 50 мкл электрофоретического буфера (pH 6,5), наносят в виде прилегающих друг к другу полосок (1 см) на лист бумаги ватман № 1. После электрофореза полосу нейтральных пептидов вырезают, пришивают к другому листу бумаги и проводят электрофорез при pH 2,1. Кислые, основные и нейтральные пептиды окрашивают на картах флуорескамином, фенантренхиноном и реактивом Паули.