Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Традиционная стратегия определения структуры белков
Контроль гомогенности и определение аминокислотной последовательности пептидов

Степень чистоты выделенных пептидов определяют с помощью электрофореза при двух pH — 2,1 и 6,5, а также аминокислотного анализа и определения N-концевого остатка. Характеристики электрофоретической подвижности пептида при pH 2,1 и 6,5 [46] в совокупности с данными аминокислотного состава позволяют оценить размер пептида и число содержащихся в нем амидных групп. Прежде чем начинать определение аминокислотной последовательности, целесообразно создать некоторый «фонд» чистых пептидов, поскольку одновременно параллельно можно анализировать до 20 образцов (подробно методики определения структуры в дансильном и ДАБИТЦ — ФИТЦ-вариантах приведены в гл. 11 и 14). Идентификация амидов дикарбоновых аминокислот в дансильной методике может быть осуществлена по электрофоретической подвижности небольшой порции исследуемого пептида до и после отщепления по Эдману остатков Asx и Glx. Альтернативный вариант заключается в определении электрофоретических характеристик (pH 6,5) коротких фрагментов исходного пептида, полученных при его ферментативном гидролизе (после установления структуры дансильным методом). Выбор фермента диктуется необходимостью идентификации конкретного остатка дикарбоновой аминокислоты в цепи, особенно удобно использовать для этой цели стафилококковую протеазу.

Поскольку надежность определения аминокислотной последовательности снижается при приближении к С-концу пептида, рекомендуется выделить С-концевой (ые) фрагмент(ы) исходного соединения, проверив еще раз его аминокислотный состав, подвижность в электрофорезе при pH 6,5 и полученные характеристики сравнить с ожидаемыми на основании имеющихся структурных данных. Погрешности в установлении С-концевой аминокислотной последовательности могут привести к неправильному соединению фрагментов и, таким образом, к значительным ошибкам при реконструкции полипептидной цепи. Разумно совместить в одном эксперименте контроль структуры С-концевои области пептида с идентификацией амидов дикарбоновых аминокислот.

Причины возможных ошибок в определении аминокислотной последовательности многообразны. Так, гистидин менее устойчив в условиях реакции, чем другие аминокислоты, и преждевременное расщепление связей по остатку гистидина может привести к его потере (пропуску) в полипептидной цепи или, что более обычно, к появлению гетерогенности в последовательности [59, 61]. Неполное отщепление аминокислоты при обработке безводной кислотой, неудовлетворительная экстракция тиазолинона или его частичная деструкция могут быть причинами ошибочной идентификации на данной стадии аминокислотного остатка, являющегося «остаточным» от предшествующего. Вероятность ошибки возрастает в тех случаях, когда N-концевыми становятся остатки пролина или триптофана, дансильные производные которых разрушаются в процессе гидролиза. Усложняет процесс идентификации возможная экстракция в органическую фазу укороченных, особенно неполярных, пептидов.

В результате неполного расщепления некоторых связей при кислотном гидролизе дансилпептида (преимущественно с N-концевыми остатками Ilе и Val) образуются дансильные производные дипептидов, которые могут быть ошибочно идентифицированы как дансиламинокислоты, поскольку положения их пятен при хроматографии на полиамидных пластинках совпадают, например дансил-Ile-Glu и дансил-Glu. Наконец, источником ошибок может быть «перекрестная» идентификация аминокислот при определении структуры негомогенного пептида. При небольшом содержании примесного пептида удается определить последовательность главного компонента смеси, но возможное блокирование основного пептида (по остаткам Gln, Тrр или связи Asn-Gly) или его предпочтительная экстракция в растворитель при промывках могут привести к тому, что минорная последовательность с определенного положения цепи будет принята за основную.