Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Протеаза из Armillaria mellea
Фермент выделен из базидиомицета Armitlaria mellea [110] и получен в виде активного препарата [60, 110, 111]. Показано, что фермент представляет собой металлопротеин (Zn2+-содержащий) с молекулярной массой 14 000 и с максимумом активности при pH 6,8. Фермент не выпускается в виде коммерческого препарата.
3.5.6.1. Специфичность и условия гидролиза.
Специфичность. При изучении специфичности фермента было показано, что гидролиз проходит по N-концевой пептидной связи остатков лизина и аминоэтилцистеина (Аес) типа -X-Lys- и -X-Аес-, даже если Х = Рrо. Расщепление связи -Pro-Lys наблюдали при обработке инсулина и других субстратов [16, 36]. Было также показано, что пептидные связи, содержащие вблизи остатков лизина кислотные остатки, устойчивы к действию фермента. В некоторых случаях наблюдается гидролиз С-концевой пептидной связи аргинина -Arg-X. Степень гидролиза по этой связи возрастает, если X = Leu или Ilе, хотя не все фрагменты этого типа подвергаются гидролизу.
Фермент из A. mellea использовали для ограниченного гидролиза иммуноглобулинов G и D [44, 48]. Результаты этих исследований свидетельствуют о его высокой специфичности.
Условия гидролиза. Гидролиз проводят в 0,2 М N-этилморфолин — ацетатном буфере (pH 8,0) при соотношении фермент : субстрат=1 : 100 при 35 °С в течение 22 ч [15] или в 0,1 М NH4HCO3 при соотношение фермент : субстрат=1 : 500Н-1000 при 37 °С [36]. Удовлетворительные результаты получены при проведении реакции в диапазоне pH 4—9 и при повышении температуры до 50 °С. Оптимальные результаты получены при обработке субстратов в 10 мМ трис — НСl-буфере (pH 7,0), содержащем 0,15 М NaCl и 2 мМ ацетат кальция, при соотношении фермент : субстрат=1 : 100 при 37 °С в течение 3 ч [44]. Фермент ингибируется в присутствии ЭДТА, а также 1 мМ раствором лизина или цистеина [111].
Специфическое расщепление по остаткам цистеина. На примере ß-цепи гемоглобина человека и токсина яда пчелы было показано, что фермент из A. mellea можно использовать для специфического гидролиза по остаткам аминоэтилцистеина [15]. После модификации остатков лизина путем трифтороацетилирования проводили алкилирование указанных белков по SH-группам с помощью этиленимина. При обработке ферментом наблюдался специфический гидролиз по всем остаткам аминоэтилцистеина за исключением фрагментов -Acc-Lys- и -Lys-Aec-.