Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Углеводсодержащие белки
Метилгликозид-триметилсилильный метод

В сотрудничестве с Дж. Клампом (Z. Clamp)

Метод разработан в лаборатории автора и подробно описывается ниже.

Метанолиз. Используют 1,0 М НСl в сухом метаноле, приготовленном перегонкой над реактивом Гриньяра. Сухой газообразный HCl из баллона (BDHLtd.) пропускают в 250 мл метанола, находящегося в ледяной бане. При умеренной скорости подачи газа за 15 мин достигается концентрация HCl>1,0 моль/л, поэтому раствор затем разбавляется сухим метанолом до концентрации 1 моль/л. Молярность обычно определяется титрованием аликвоты раствора гидроксидом натрия. Затем раствор HCl в метаноле разливают в 10-мл ампулы, которые продувают азотом, запаивают и хранят при — 20 °С.

Количество гликопротеина, необходимое для анализа, определяется содержанием в нем углеводов и в оптимальном варианте составляет 25—125 нмоль каждого моносахарида. При исследовании нового белка обычно берутся пробы по 1—2 мг, что при обычном (среднем) содержании углеводов дает достоверные результаты. Пробу белка (гликопротеина) с введенными внутренними стандартами — маннитом (100 нмоль) и перевитом (100 нмоль) — помещают в ампулу на 2 мл и высушивают. К сухому остатку приливают 0,5 мл НСl в метаноле, продувают азотом, запаивают и нагревают 24 ч при 85 °С.

По окончании метанолиза смесь нейтрализуют карбонатом серебра, тонкорастертый порошок которого добавляют небольшими порциями, контролируя pH среды с помощью индикаторной бумаги с узкими интервалами значений pH.

N-Ацетилирование. В процессе метанолиза происходит частичное деацетилирование N-ацетилгексозаминов. Для блокирования освободившихся групп требуется дополнительное ацетилирование, которое осуществляется добавлением 0,1 мл уксусного ангидрида к нейтрализованной реакционной смеси, что одновременно препятствует адсорбции сахаров на частицах хлорид-карбоната серебра. Смесь оставляют стоять 6 ч и затем центрифугируют. Супернатант переносят в 5 мл грушевидную колбу. К остатку в ампуле добавляют 0,5 мл метанола, перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость также переносят в ампулу. Процедуру повторяют дважды и объединенные растворы упаривают при 35 °С. Очень важно при этом тщательно удалить следы уксусного ангидрида, поэтому при сохранении характерного запаха к остатку еще раз приливают метанол и вновь высушивают. После добавления третьего внутреннего стандарта — арабита (50 нмоль в метаноле) — вновь упаривают смесь при нагревании. В реакционной колбе таким образом находятся метиловые эфиры метилгликозидов моносахаридов, внутренние стандарты — арабит, маннит и персеит в смеси с некоторыми аминокислотами и пептидами, образовавшимися в результате разрушения полипептидной цепи и не мешающими дальнейшему анализу. На этой стадии высушенный образец может храниться в вакуумном эксикаторе над пентаоксидом фосфора до анализа.

Триметилсилилирование. Свободные гидроксильные группы сахаров должны быть защищены перед проведением газовой хроматографии и триметилсилилирование является для этого идеальной процедурой. Реакция протекает быстро и количественно, при комнатной температуре, а введение большого числа метильных групп приводит к повышению чувствительности определения с помощью пламенно-ионизационного детектора. В качестве реагента используют смесь триметилхлоросилан — гексаметилдисилазан — пиридин (1:1:5). Готовят ее еженедельно и хранят в плотно закрытом сосуде. При стоянии возможно образование небольшого количества хлорида аммония, который удаляют центрифугированием перед использованием реагента. К сухому образцу прибавляют 0,05 мл смеси реагентов и оставляют на 30 мин при комнатной температуре без доступа влаги (можно использовать «сухую» камеру). Затем реакционную смесь центрифугируют и 1—5 мкл супернатанта вводят в газовый хроматограф.

Газожидкостная хроматография. Из практического опыта следует, что большинство проблем, встречающихся при использовании метода газовой хроматографии, связано с несоблюдением требований к набивке колонки. Здесь важно соблюдать каждое, даже пусть мелкое указание. Используют стеклянные колонки размером 2 мХ2—3 мм (внутренний диаметр). Упаковка — высококачественный диатомит, промытый кислотой и силанизированный, покрытый 3—4% фазы SE-30. Соответствующие материалы поставляют ряд фирм. После инжекции включают программу нагревания от 120 до 210 °С со скоростью 1 град/мин.

Для вычисления поправочных коэффициентов по внутренним стандартам через колонку по полной программе пропускают смесь моносахаридов. С нейтральными гексозами обычно не возникает проблем, но полярные сахара — N-ацетилгексозамины и сиаловые кислоты — выступают прямо-таки как чувствительные индикаторы эффективности работы колонки. Пики сахаров должны быть строго симметричны, появление небольших или размытых пиков свидетельствует о плохом состоянии колонки.

Для приведения колонки в рабочий режим периодически по нескольку часов через нее пропускают смесь для триметилсилилирования в медленном потоке азота при 120 °С. В зависимости от исходного состояния колонки для этого может потребоваться несколько дней или даже недель, процесс можно ускорить пропусканием через определенные интервалы времени смеси сахаров-стандартов. Подробности метода описаны в работах [25, 52, 67, 68, 70, 71].

5.22.3. Определение уроновых кислот, гексозаминов и галактозы гликозаминогликанов метилгликозидтриметилсилильным методом [98]

Производные углеводов приготовлены по модифицированной методике [70] (см. также предыдущий раздел).

Газожидкостная хроматография. Колонка из плавленного кварца (25 мХ0,32 мм) с жидкой фазой CP→Sil₅ (фирма Chrompak); пламенно-ионизационный детектор; скорости потоков газа-носителя (N₂) 0,7 мл/мин, газа-ускорителя к детектору 30 мл/мин; температура ввода 22 °С, температура детектора 280 °С; температурная программа от 135 до 215 °С, 1 град/мин. Разделение всех пертриметилсилильных производных метилгликозидов, включая арабит, маннит, маннозу, глюкозу (2 пика) и галактозу (4 пика), достигается менее чем за 60 мин. Выходы производных моносахаридов для всех изученных гликозаминогликанов >87% (в расчете на гексозамин).