Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Углеводсодержащие белки
Чувствительный метилгликозид-триметилсилильный метод
Образец гликопротеина (0,5—10 мкг) или стандарта-углевода (0,1 — 1 нмоль) высушивают над Р5О5 в вакууме в сосуде объемом 100 мкл типа Reactivial. В качестве внутреннего стандарта может быть использован мезоинозит. Добавляют сухой раствор НСl в метаноле (40 мкл, 0,625 моль/л) и метилацетат (10 мкл). Закрывают сосуд пробкой с тефлоновой прокладкой, перемешивают на вибраторе и выдерживают 16 ч при 70 °С. Охлаждают. Добавляют трет-бутиловый спирт (10 мкл) и высушивают в потоке азота, не содержащего следов кислорода.
N-Ацетизирование, К остатку при перемешивании последовательно добавляют метанол (50 мкл), пиридин (5 мкл), уксусный ангидрид (5 мкл) и оставляют на 15 мин. Тщательно высушивают сначала в потоке азота, а затем в вакууме над Р2О5. Силилируют добавлением 20 мкл силилирующего агента ((Sylon НТР, фирма Supelco). Перемешивают на вибромешалке и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Высушивают. Остаток немедленно растворяют в 14 мкл гексана и наносят все количество образца на колонку газожидкостного хроматографа.
Газожидкостная хроматография. Капиллярная колонка из плавленного кварца WCOT (25 мХ0,32 мм) с жидкой фазой CP-Sil 5 (фирма Chrompak); температурная программа: нагревание 140 °С в течение 12 мин, затем повышение температуры со скоростью 8 град/мин до 260 °С; пламенно-ионизационный детектор.
Разделение 29 ТМС-производных простых сахаров, аминосахаров кислот достигнуто менее чем за 16 мин. Чувствительность <100 пмоль для каждого пика.