Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Углеводсодержащие белки
Введение

В сотрудничестве с Дж. Клампом (7. Clamp)

Гликопротеины относятся к биополимерным молекулам, широко распространенным в живых организмах. Они могут быть внутри- и внеклеточными, присутствовать в качестве мембранных компонентов или в растворе, существовать в форме фибриллярных структур или типичных глобулярных белков. Более половины всех изученных детально белков содержат ковалентно присоединенные сахара, поэтому при исследовании нового белка всегда нужно иметь в виду, что это может быть гликопротеин.

Влияние присутствия углеводных компонентов на свойства белковой молекулы зависит от их содержания, которое варьирует в широких пределах от ≤1% до ≥80%. Присоединение к пептидной цепи среднего размера одной или двух небольших олигосахаридных цепей, почти никак не сказывается на типично «белковых» свойствах соединений. В то же время гликопротеины с высоким содержанием сахаров фактически ведут себя как полисахариды. Большинство гликопротеинов, однако, характеризуется содержанием углеводов, средним между этими двумя экстремальными случаями. Любой белок может быть «заподозрен» в своей принадлежности к гликопротеинам, особенно в случае аномального поведения при гель-фильтрации, ультра- центрифугировании, окрашивании, измерении ультрафиолетового поглощения и т. д.

Простейший способ подтверждения возникающего предположения, применяемый многими исследователями в этой области,— поиск в образце с помощью аминокислотного анализа гексозаминов, наиболее распространенные из которых глюкозамин и галактозамин. Для большинства аминокислотных анализаторов прилагаемые руководства включают данные о поведении этих двух гексозаминов в применяемой системе, если же эти данные не приводятся, то нетрудно сделать это экспериментальным путем. Следует иметь в виду, однако, что не все гликопротеины содержат гексозамин и значительное количество углеводов разрушается в жестких условиях гидролиза, используемого при аминокислотном анализе.

Наиболее часто типичные гликопротеины млекопитающих содержат следующие моносахариды: L-фукозу (6-дезокси-L-галактоза), D-маннозу, D-галактозу, N-ацетил-о-глюкозамин (2-ацетамид-2-дезокси-о-глюкоза) и сиаловые кислоты (различные производные нейраминовой кислоты). В состав некоторых гликопротеинов входят D-глюкоза или N-ацетил-о-галактозамип (2-ацетамид-2-дезокси-D-галактоза). Наилучшие результаты для разделения, идентификации и количественного определения этих семи моносахаридов достигаются с помощью газожидкостной хроматографии. Существует два основных метода модификации сахаров для последующего анализа газожидкостной хроматографией: альдит-ацетатный и метилгликозид-триметилсилильный. Первый включает водный кислый гидролиз с последующим восстановлением образующихся альдоз до соответствующих альдитов и их ацетилирование; второй основан на применении метанолиза, приводящего к образованию метилгликозидов и метиловых эфиров сиаловых кислот, которые затем превращаются в триметилсилильные производные.

Следует иметь в виду, что белки, для которых в качестве стадии очистки использовались колонки с сефадексом, могут содержать глюкозу в качестве примеси.