Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Контроль качества работы прибора
Успешная работа прибора зависит от внимания оператора к частностям процесса, от предотвращения или раннего обнаружения неполадок. Прежде всего перед началом каждого анализа надо убедиться в достижении требуемого значения вакуума во всей системе (путем включения реактора), в отсутствии протечек жидкостей через клапаны подачи реагентов (растворителей). Следует проверить количество реагентов и растворителей в бутылях и степень герметизации самих бутылей. Удивительно то, что во многих лабораториях пренебрегают соблюдением этих простых правил. Используя секвенаторы в нашей лаборатории почти 13 лет, мы регулярно (еженедельно) анализируем миоглобин на каждом приборе. Это может показаться излишеством, но в действительности только так можно своевременно обнаружить ухудшение работы каждого прибора. Кроме того, практически каждый анализ радиоактивно меченных образцов проводится с использованием внутреннего стандарта ([35S]иммуноглобулина, продуцируемого плазмацитомой МОРС21). Уникальность препарата заключается в том, что МОРС21 выращивается на среде, содержащей [35S]Met. Из надосадочной жидкости этой культуры после диализа и разделения в восстанавливающих условиях в ПААГ получают белки (две полосы в геле, содержащие радиоактивность), соответствующие тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина. Легкая цепь содержит остатки [35S]Met в положениях 4, 11, 13, тогда как в тяжелой цепи первый остаток [35S]Met находится в положении 34. Поэтому для большинства целей сама диализированная надосадочная жидкость может служить внутренним стандартом. Для более точной количественной оценки работоспособности секвенатора можно разделить цепи в ДСН—ПААГ или на сефадексе и нанести легкую цепь в реактор прибора. Этот прием идеален с нескольких точек зрения. Во-первых, можно точно определить постадийный выход на основе данных 4, 11, 13-го циклов отщепления. Во-вторых, сам процесе отщепления можно провести в течение ночи. В наших условиях выходы составляют 92—97% и практически всегда совпадают с результатами анализа миоглобина. В-третьих, можно смешать миоглобин с меченой легкой цепью, провести 12 циклов отщепления (Val- Leu-Ser-Glu-Gly-Glu-Trp-Gln-Leu-Val-Leu-His-Val-Trp→) и продукты отщепления циклов 1, 2, 10, 11 анализировать методом ГЖХ и ВЭЖХ, а циклов 4, 11, 13 — оценить на содержание радиоактивности. При расхождении постадийных выходов для этих двух стандартов (обычно выходы для миоглобина ниже, чем для меченой легкой цепи) причиной этого расхождения чаще всего является неэффективная работа системы превращения ТА в ФТГ-производные аминокислот (плохое качество этилацетата, перегрев конвертора, загрязнения в системе продувки азотом, перегрев испарителя, и т. д.)
В нашей лаборатории используются еще два способа контроля состояния прибора. Оба они заключаются в постоянной записи температуры в ходе- всего опыта. Подключение недорогого самописца к датчику температуры реактора дает оператору ту же информацию, что и кардиограмма кардиологу. Этим путем можно достоверно контролировать включение — выключение клапанов, подачу и отбор реагентов, растворителей, эффективность вакуумирования. Таким же образом мы контролируем температуру в охлаждаемых ловушках. Температура ловушки — мера эффективности ее работы, а поэтому и мера эффективности всего процесса. Датчики присоединены к главному блоку управления; изменение температуры фиксируется на ленте самописца. Вместе с тем регистрация температуры ловушки позволяет следить, за степенью заполнения криогенной системы для своевременного размораживания ее. На необходимость размораживания указывает и быстрое падение эффективности вакуумирования. В условиях влажного климата серьезную проблему представляет конденсация паров влаги воздуха на поверхности ловушки во время работы и во время размораживания. Баня с охлажденными этанолом разбавляется водой, что ведет к значительному повышению температуры внутри охлаждающего пальца и, далее, к неэффективному вымораживанию растворителей и реагентов. В этом случае- слежение за температурой позволяет своевременно устранить недостатки в работе системы охлаждения.
От редактора. Данные о последовательностях могут быть получены по» следующим адресам:
Для нуклеиновых кислот:
Genhank, 10, Moulton Street, Cambridge, МА 02238, U.S.А.
EMBL Nucleotide Sequence Data Library, EMBL, Postfach 10 22 09, D-6900 Нeidelberg, West Germany.
Для белков:
Protein Sequence Database, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, 3900 Reservoir Road, N.W., Washington, DC 20007, U.S.A.
Professor R. F. Doolitle, Department of Chemistry, University of California,. San Diego, La Jolla, California, U.S.A. 92093.
Адреса любезно представлены д-ром Р. Стаденом (Rodger Staden).