Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидов химическими методами
Расщепление по остатку триптофана
Расщепление по остатку триптофана о-иодозобензойной кислотой

Согласно предложенному методу; белок в 80%-ной уксусной кислоте обрабатывают о-иодозобензойной кислотой в присутствии 4 М гуанидин-НСl [120]. Реакция идет избирательно с выходом 70—100%. Однако последующие исследования показали, что метод не столь специфичен, а выход не столь высок, как сообщалось [51—54, 99, 198]. По выходу продуктов реакции предложенная методика сопоставима с другими, где происходит расщепление по триптофану; кроме того, побочно идет расщепление по остатку тирозина. Более детальные исследования показали [52, 53], что в указанных условиях (80%-ная уксусная кислота, 4 М гуанидин-НСl) происходит окислительное галогенирование индольного ядра триптофана и бензольного кольца тирозина с одновременным расщеплением пептидной связи. Если из реакционной смеси исключить галоген, расщепления пептидной связи не происходит. Механизм реакции, вероятно, аналогичен другим реакциям с использованием галогенирующих реагентов (в том числе N-бромосукцинимида). Высказано предположение, что при инкубации 5-иодозобензойной кислоты в кислой среде в присутствии галогенов идет несколько равновесных реакций с образованием ряда промежуточных галогенирующих соединений, включая свободный галоген [уравнение (2.16)]. Следовательно, окислительное галогенирование, приводящее к расщеплению по триптофану и тирозину, обусловлено свойствами системы о-иодозобензойная кислота — 4 М гуанидин-HCl, а не присутствием примесей в реагентах, например о-иодоксибензойной кислоты [121, 122]. На практике чистоту реагентов проверяют с помощью различных тестов [52, 53]. С целью свести к минимуму расщепление по тирозину в реакционную смесь предложено добавлять n-крезол [52, 122]. С такими изменениями метод вполне может быть использован для расщепления белков по остатку триптофана.

2.5.5.1. Методика [122]. о-Иодозобензойную кислоту (10 мг) растворяют в 80%-ной уксусной кислоте, содержащей 4 М гуанидин-HCl и 20 мкл n-крезола, и инкубируют при 20 °С в течение 2 ч. Затем прибавляют образец белка (5 мг) и инкубируют без доступа света при 20 °С в течение 24 ч. Пептидные фрагменты выделяют с помощью гeль-фильтрации на сефадексе.