Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Дисульфидные связи
Специальные методы
Специфическое расщепление по остаткам цистеина

К высокоспецифическим методам относятся расщепление по остаткам цистеина с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (НТБК) [25]. Эффективность этого метода была продемонстрирована на примере антигенов гистосовместимости, когда с помощью этой методики сравнивались последовательно расположенные дисульфидные петли [15]. Размеры дисульфидных циклов определяли по длине полученных фрагментов. Метод может найти применение при выявлении структурной гомологии родственных белков. К сожалению, образующиеся фрагменты имеют на N-конце тиазолидиновые циклы и не могут быть секвенированы непосредственно. Имеются данные, что деблокирование можно проводить на никеле Ренея [32] (гл. 2). При этом остатки цистина превращаются в аланин, остатки метионина — в ß-аминомасляную кислоту, становится возможным секвенирование.

4.7.3.1. Расщепление 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислотой [10, 15]. Образец лиофилизованного белка (несколько нмоль) растворяют в 0,2 М трис-ацетатном буфере (pH 8,0), содержащем 6 М гуанидин-НСl+2 мМ дитиотреит+1 мМ ЭТДА, и инкубируют при 37 °С в течение 2 ч. Затем образец разбавляют 0,7 мл исходного буфера и добавляют 0,5 мл 30 мМ НТБК. Инкубируют реакционную смесь при 20 °С в течение 30 мин, доводят pH до 9,5 с помощью 1 М NaOH и вновь инкубируют при 55 °С в течение 24 ч. Реакцию останавливают путем подкисления до pH 4 ледяной уксусной кислотой.