Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Обсуждение
Иммобилизация образца и чувствительность прибора

По сравнению с секвенаторами других типов ГФ-прибор позволяет проводить определение аминокислотной последовательности белков (пептидов) на меньшем количестве материала [4].

РИС. 17.7. Хроматограммы продуктов отщепления при анализе аминокислотной последовательности 50 пмоль ангиотензина II человека. Чувствительность 0,005 ед. опт. плотн. на шкалу. Хроматограмма записана с помощью системы обработки данных (компьютер 3354, фирмы Hewlett-Packard) с вычитанием базовой линии, полученной в холостом анализе (в инжектор введено 10 мкл ацетонитрила). Порядок элюирования ФТГ-производных аминокислот (12,5 пмоль каждого): Asn, Ser, Thr, Gin, Gly, Ala, His, Asp-О-Ме, Glu-O-Mc, Tyr, Val, Pro, Met, Ile, Leu, Phe, Trp, Lys, Arg. На колонку введено по 10 мкл раствора (40% каждого образца). Положение и природа аминокислот в циклах 1—6 показано в трехбуквенном обозначении. Положение ожидаемых ФТГ-производных аминокислот в циклах 7 и 8 показано таким же образом, хотя они и не обнаружены в эксперименте.

Это преимущество обусловлено эффективной иммобилизацией образца в ходе расщепления по Эдману даже в отсутствие ковалентного присоединения к твердофазному носителю. Пептид (белок) остается устойчиво связанным с фильтром по следующим причинам:

1) и основание (триметиламин — вода, реакция присоединения ФИТЦ), и кислота (ТФУ), реакция отщепления тиазолинона) подаются в раствор в газообразном состоянии;

2) образец закрепляется в пленке полибрена, что придает ему устойчивость к вымыванию органическими растворителями (бензол, этилацетат, 1-хлоробутан), используемыми для удаления избытка реагентов, основных и побочных продуктов реакций. Поскольку после нанесения на стекловолокнистый фильтр белок (пептид) связывается с фильтром, образующим рабочую поверхность реактора путем простого высушивания, то исключены начальные потери образца, присущие неэффективным методам ковалентного присоединения полипептида к носителю. То обстоятельство, что образец остается иммобилизованным в ходе повторяющихся циклов отщепления, дает возможность существенно уменьшить объем реакционной камеры, выполненной в виде небольшого стеклянного патрона. В отличие от ЖФ-секвенатора в ГФ-приборе для поддержания образца в виде тонкой пленки не требуется вращения реактора, так как полипептид перед анализом нанесен и высушен в виде пленки, которая остается нерастворенной в течение всех последующих процессов и не теряет своей формы. Проточный вариант конструкции реакционной ячейки позволяет избежать жестких требований к точности дозировки реагентов и растворителей. Реакции присоединения ФИТЦ и отщепления тиазолинонов происходят при подаче триметиламина (ТМА) и ТФУ в газовой фазе. Единственный реактив, требующий точной дозировки, это ФИТЦ, который должен добавляться в количестве, обеспечивающем полное смачивание фильтра с образцом.

Использование пористого фильтра и проточного принципа проведения процесса позволяет проводить высокочувствительный анализ при низком уровне химического фона. Диск представляет собой сетку из переплетенных волокон, имеющую сильно развитую поверхность, на которой находится высушенная газо- и жидкостнопроницаемая пленка, состоящая из белка и полибрена. Кроме того, благодаря малой толщине пористого диска создается низкое сопротивление потоку жидкости. Это обеспечивает максимальный массообмен реактивов и растворителей с образцом. При малых скоростях потока можно достичь высокой эффективности и химических реакций, и экстракций, что позволяет экономно расходовать дорогостоящие реагенты и растворители (табл. 17.1).

При использовании малых объемов жидкостей сводится к минимуму и содержание примесей, присутствующих даже в ультрачистых реактивах и имеющих поглощение при длине волны детекции ФТГ-производных аминокислот (254 нм). При анализе последовательности на микроуровне (<100 пикомоль исходного материала) надежность интерпретации хроматограмм ВЭЖХ в значительной степени зависит от возможности получения стабильной и воспроизводимой базовой линии при длине волны 254 нм (рис. 17.7).