Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Введение
Б. ВИТТМАН-ЛИБОЛЬД (В. WITT.MANN-LIE-
BOLD, Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik, Abteilung Wittman, Ihnestrasse 63—73, D-1000 Berlin 33 (Dahlem)).
Впечатляющие успехи, достигнутые в последние десятилетия в определении первичной структуры белков, стали возможны благодаря, во-первых, введению в практику метода последовательного отщепления аминокислот от пептидов и белков при помощи фенилизотиоцианата (ФИТЦ) [14] и, во-вторых, разработке автоматического варианта этого метода [15]. Фенилизотиоционат до сих пор сохранил свое значение для определения аминокислотной последовательности белков. Во многих лабораториях все еще пользуются ручными вариантами определения последовательности (например, методика, объединяющая отщепление по Эдману с идентификацией ДНС-аминокислот [19], полуавтоматический вариант определения с использованием ФИТЦ или недавно разработанный метод, основанный на совместном использовании 4-N,N'-диметиламиноазобензол-4'-изотиоцианата (ДАБИТЦ) и ФИТЦ [58]. Ручные модификации метода применяются по следующим причинам:
1) анализ аминокислотной последовательности часто проводится либо небольшими группами аналитиков-белковиков, либо лицами, не специалистами в химии белка. В обоих случаях трудно приобрести секвенатор и обеспечить его техническое обслуживание;
2) при наличии квалифицированного персонала использование методик ручного анализа позволяет успешно проводить определение;
3) один человек может работать одновременно с 8—16 пептидами.
Хотя автоматический анализ требует больших затрат труда и средств для поддержания оборудования в работоспособном состоянии, он имеет преимущества перед ручными методами (абсолютная воспроизводимость условий для всех циклов отщепления, более эффективное удаление кислорода, каждый цикл отщепления проходит с более высоким выходом, возможна круглосуточная работа прибора). Кроме того, можно с успехом анализировать нерастворимые пептиды или те пептиды, которые в ходе анализа становятся очень гидрофобными. Для реализации очевидных преимуществ автоматического метода были разработаны различные варианты секвенаторов: жидкофазного (ЖФ) [15, 64], твердофазного (ТФ) [27, 35], газофазного (ГФ) [22] (см. в гл. 17 обсуждение последних достижений газофазного метода). В этой главе рассмотрен только ТФ-метод.
Принцип ТФ-анализа аминокислотной последовательности заключается в ковалентном связывании пептида с нерастворимым носителем и последующим отщеплении (при помощи ФИТЦ) аминокислот от пептида, связанного с носителем. Разработан набор методов присоединения пептидов и белков к носителям, применяемым в виде шариков (производные полистирола или стекла, содержащие различные функциональные группы [33]). Носитель с ковалентно присоединенным пептидом (пептидил-носитель) можно упаковать в колонку и тщательно промыть реагентами и растворителями, используемыми в процессе анализа (при этом в отличие от ЖФ-метода нет опасности вымывания образца). После проведения полного цикла отщепления анилинотиазолинон АТЗ-аминокислоты вымывают из колонки, а пептид, укороченный на одну аминокислоту, остается присоединенным к носителю и доступным для проведения следующего цикла реакций.
ТФ-секвенатор легче обслуживать, чем жидкофазный, но новички часто затрудняются в выборе наилучшего метода присоединения конкретного пептида. Поэтому в данной главе в основном рассматриваются наиболее эффективные (с нашей точки зрения) методы синтеза носителей и присоединения пептидов. В настоящее время для анализа последовательности используют как большие, так и очень малые навески образца. Поэтому излагаемые в этой главе методы рассчитаны па работу с количествами от 500 пмоль до 20 нмоль пептида. Описываются только те методы, при использовании которых мы получали удовлетворительные результаты па пептидах, выделенных из реальных биологических объектов. Более подробную информацию можно найти в статьях, посвященных анализу на микроуровне [25, 52, 63], а также в обзорах по методам анализа последовательности [70, 71].