Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Материалы
Растворители

Для ТФ-анализа не обязательно использовать растворители высшей степени чистоты; в большинстве случаев достаточно, чтобы они имели квалификацию «ч. д. а.». Данные по определению аминокислотной последовательности, проведенные в разных лабораториях с использованием реактивов разных фирм, дали сходные результаты. Однако для анализа на микроуровне необходимы растворители, свободные от примесей, присутствие которых может привести к образованию побочных продуктов, влияющих на результаты идентификации. Поэтому ниже приводятся методики очистки растворителей. Следует контролировать качество каждой очищенной партии, так как степень очистки может меняться от партии к партии.

Следует обязательно проверять наличие альдегидов и пероксидов в реактивах и растворителях; рекомендуется проводить (без добавления пептида) все этапы методики присоединения образца к носителю и использовать обработанный таким образом носитель для анализа на секвенаторе (холостой опыт).

Если на хроматограммах ГЖХ или ВЭЖХ отсутствуют пики примесей, а на пластинках ТСХ не обнаруживаются пятна при анализе тех же аликвот, что и при анализе структуры пептидов, то качество растворителей (реактивов) признается удовлетворительным. Кроме того, рекомендуется проводить пробные определения с использованием полипептидов известной структуры.

12.2.1.1. Методики очистки [68, 72].

Ацетон (фирма Merck, марка «для анализа»). 2,5 л ацетона пропускают через колонку (внутренний диаметр 35 мм), заполненную силикагелем (высота слоя 80 мм) марки «Silica 100—200, активный» и нейтральным оксидом алюминия (Alumina N активность I, фирма Woelm Pharma) и перегоняют в стеклянном приборе (t_кип 56 °С). Растворитель хранят над молекулярными ситами типа 13х, фракция 1/16" (фирма Packard) или над ситами типа 3 Å, диаметр частиц 2 мм (фирма Merck).

Ацетонитрил (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают так же, как ацетон. t_кип 81—82 °С. Хранят под азотом при 10 °С.

1,2-Дихлорэтан (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают и хранят, как ацетонитрил. t_кип 84 °С.

Диметилформамид (ДМФА) (фирма Merck, марка «для анализа»). Перегоняют смесь 263 мл ДМФА+34 мл бензола+12 мл воды; первые 60 мл дистиллята, кипящего до 150 °С, отбрасывают; фракцию, кипящую выше 150 °С, собирают и перегоняют над Р₂О₅ при пониженном давлении (водоструйный насос). ДМФА хранят над молекулярными ситами, как ацетон (см. выше).

Этаноламин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют под вакуумом (15 мм рт. ст.) при 77°С. Молекулярная масса 61,08. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

N-Этилморфолин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют дважды: сначала над борогидридом натрия, затем над пингидрином. Затем перегоняют на колонке, заполненной стеклянными кольцами. t_кип 138— 139 °С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Метанол (фирма Merck, марка «Uvasol»). Очищают и хранят, как ацетонитрил. t_кип 64 °С.

N-Метил морфолин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Очищают, как N-этилморфолин. tкип 115—116 °С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Пиридин (фирма Merck, марка «для анализа»). Перегоняют последовательно над едким кали, нингидрином и вновь над едким кали. t_кип 114— 116 °С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Толуол (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают, как ацетон, перегоняют над CaSO₄∙0,5H₂O (прокаленным при 500 °С непосредственно перед использованием). tкип 110—111 °С. Хранят над молекулярными ситами, как ацетон.

Триэтиламин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют над фталевым ангидридом. t_кип 89 °С. Хранят в ампулах под азотом при — 20 °С.

Триэтилентетрамин (фирма Fluka, марка «для практики»). Очищают, как триэтиламин, перегоняют при пониженном давлении (водоструйный насос). Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Трифтороуксусная кислота (ТФУ) (фирма Fluka, марка «ч.»). Перегоняют над CaSO_4∙0,5H₂O (прокаленным при 500 °С непосредственно перед использованием) с колонкой, заполненной стеклянными кольцами. tкип 72—73 °С. Хранят порциями по 50 мл в колбах со стеклянными пробками под азотом при —20 °С.

Вода. Дважды перегоняют в стеклянном приборе. Используют свежеперегнанной.