Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Традиционная стратегия определения структуры белков
Фракционирование растворимых пептидов

Выбор оптимальной схемы фракционирования смеси пептидов основан па предварительной информации об их общем числе, размерах, величине зарядов и растворимости. Как правило, крупные фрагменты менее растворимы, чем короткие, а размер пептидов, как и заряд, определяются природой использованной для гидролиза протеазы. Например, триптические пептиды обычно бывают кислыми, а не основными, поскольку вероятность содержания в них по крайней мере двух кислых аминокислот больше, чем внутренних остатков лизина и аргинина или двух гистидинов. В планировании схемы фракционирования, однако, гораздо более полезным, чем свод общих правил, оказывается проведение аналитического картирования на бумаге исследуемой смеси с окрашиванием пептидов нингидрином и селективными реагентами. Получение обычной пептидной карты включает электрофорез при pH 6,5 в одном направлении и хроматографию в системе бутанол — уксусная кислота — вода — пиридин (БУВП) в перпендикулярном направлении (табл. 10.4). Поскольку при гидролизе возможно образование значительного числа нейтральных пептидов, полосу при pH 6,5 вырезают и подвергают электрофорезу при pH 2,1. Если по результатам картирования в смеси преобладают крупные кислые пептиды, то па первой стадии разделения целесообразно использовать такую смолу, как ДЭАЭ-целлюлоза, при наличии значительного числа нейтральных и основных пептидов рекомендуется применять дауэкс-50. Хорошая пептидная карта на этой стадии очень полезна и для оценки общего числа компонентов в гидролизате, позволяющей контролировать возможные потери пептидов при дальнейшей очистке.

Таблица 10.4. Условия высоковольтного электрофореза и хроматографии на бумаге. Нагрузка смеси пептидов <50 нмоль/см каждого пептида для ватмана № 1 или 200 нмоль/см для ватмана 3 ММ

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекулярной массы (до 40 000). Крупные фрагменты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракционирования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко не ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембранные белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза; гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях па полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые затем разделяют па дауэксе-50, структура пептидов, содержащихся в негомогенных фракциях, может быть установлена с помощью масс-спектрометрического анализа [44]. В последние годы широкое применение для быстрого разделения пептидов нашел метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (гл. 6).