Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Традиционная стратегия определения структуры белков
Ферментативный гидролиз

До проведения ферментативного гидролиза образец белка должен быть денатурирован и остатки цистеина в нем превращены в гидрофильные производные. С этой целью дисульфидные связи в белке предварительно восстанавливают дитиотреитом [37] и цистеины модифицируют иодоуксусной кислотой (для введения радиоактивной метки используют [¹⁴С] иодоуксусную кислоту), иодоацетамидом [31], этиленимином [66] или окисляют надмуравьиной кислотой [30]. Выбор реагента определяется общей стратегией исследования. Более подробно реакции модификации рассмотрены в гл. 2.

Обработка падмуравьиной кислотой приводит к окислению кроме остатков цистеина также остатков метионина и триптофана и обычно дает более растворимые продукты, чем восстановительное алкилирование. Для создания в белке дополнительных связей, подвергающихся гидролизу трипсином или протеазой А. mellea, применяют аминоэтилирование остатков цистеина.

В идеальном случае в результате протеолитического расщепления каждый участок полипептидной цепи будет представлен в гидролизате одним единственным пептидом, образовавшимся с максимально возможным выходом. Реально такое положение не достигается, поскольку каждая протеаза в отдельных участках полипептидной цепи проявляет различную степень сродства и гидролизует связи с различной скоростью. Однако можно ограничить процесс протеолиза точками наибольшего сродства. В общем случае это достигается путем уменьшения соотношения фермент: субстрат или путем увеличения объема добавленного буферного раствора; сокращение времени гидролиза также приводит к увеличению выхода фрагментов, образующихся в результате быстрого расщепления по наиболее «активным» точкам. «Мягкие» условия гидролиза белков для нескольких протеолитических ферментов приведены в табл. 10.3. Протеолитическое расщепление может проводиться под контролем с помощью рН-стата [18]: прекращение поглощения кислоты пли основания свидетельствует о завершении процесса.

Таблица 10.3. Условия гидролиза белков некоторыми протеазами (37°С)^а

^а Концентрации белка-субстрата 1 мг/мл в 0.5% (по несу) аммоний бикарбонате, pH 8.0. Аналогичные условия могут быть использованы для гидролиза очищенных пептидов (1 мкм/мл). Условия фрагментации пептидов термолизином; 1/100 00 °С, 2 ч; пепсином — 1/100, 37 °С 4 ч в 5%-ной муравьиной кислоте.

Причиной «неспецифичности» расщепления данным ферментом может быть наличие в нем примесей других протеаз. Например, трипсин может содержать примесь химотрипсина, от которой освобождаются с помощью аффинной хроматографии, а триптическая активность в химотрипсине подавляется добавлением ингибитора трипсина перед проведением гидролиза.

Обычно денатурированный белок нерастворим в аммоний-бикарбонатном буфере, применяемом для протеолиза, и должен предварительно солюбилизироваться или по крайней мере превращаться в топкую суспензию. Для этого лиофилизованный препарат белка растворяют в минимальном объеме денатурирующего агента (6 М гуанидинхлорид, 8 М мочевина, 100%-ная муравьиная кислота или концентрированный водный аммиак) и разбавляют значительно большим объемом буферного раствора, Гидролиз трипсином, химотрипсином, эластазой можно проводить в 2 М растворе мочевины [24], а стафилококковой протеазой в 4 М мочевине [15]. Если для растворения белка использовались муравьиная кислота или аммиак, то буферный раствор соответственно подщелачивают аммиаком или подкисляют муравьиной кислотой до pH 8 (поскольку формиат аммония летучее соединение, то в последующем обессоливании нет необходимости). Применение мочевины и особенно гуанидинхлорида требует проведения обессоливания на одной из заключительных стадий.

Контроль за ходом процесса протеолиза в суспензии может осуществляться измерением поглощения образовавшихся пептидов в небольшой пробе супернатанта (после отделения осадка) при 280 нм или определением радиоактивности [¹⁴С]карбоксиметилцистеина. О завершении гидролиза судят по исчезновению полосы исходного белка в полиакриламидном геле. Во время проведения анализа основную массу гидролизата храпят при — 20 °С, и в случае, если процесс прошел неполно, образец размораживают и протеолиз продолжают. На конечной стадии нерастворимые пептиды отделяют центрифугированием и обе части гидролизата лиофилизуют. Целесообразно нерастворимые пептиды подвергнуть повторному гидролизу с большей нагрузкой фермента и присоединить образовавшиеся пептиды к основной массе (см. также гл. 3).