Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Традиционная стратегия определения структуры белков
Фракционирование растворимых пептидов
Гель-фильтрация
Метод гель-фильтрации широко используют на первой стадии разделения, поскольку при этом обычно достигаются высокие выходы, а крупные пептиды часто получаются в состоянии, не требующем дальнейшей очистки. Растворимые пептиды наносят на колонки с сефадексом G-50 или G-25 в аммонийбикарбонатном буфере и элюируют этим же буфером, контролируя процесс фракционирования спектрофотометрически при 280 нм (максимум поглощения остатков триптофана и тирозина) и 230 нм (максимум поглощения пептидной связи). Для полного растворения исходной смеси в небольшом объеме (для нанесения па колонку) иногда следует добавить небольшое количество кристаллической мочевины. Пептиды, полученные при гидролизе пепсином, плохо растворяются при нейтральном pH, их солюбилизируют в небольшом объеме 100%-ной муравьиной кислоты, разбавляют до 5%-ной концентрации и наносят на колонки с сефадексом или биогелем, уравновешенные тем же раствором.
Небольшие порции каждой из полученных фракций анализируют методом высоковольтного электрофореза на бумаге, у «условно чистых» пептидов определяют N-концевую аминокислоту и иногда частичную аминокислотную последовательность по методу Эдмана в дансильном варианте (гл. 11). Из фракций, содержащих гомогенные по всем показателям пептиды, отбирают аликвоты на аминокислотный анализ, после чего их лиофилизуют. Крупные пептиды (20—50 остатков), даже чистые, часто проявляются на электрофореграммах в виде диффузных полос в отличие от небольших фрагментов, получающихся при их гидролизе, образующих четкие зоны при электрофорезе. Это позволяет при повторной фрагментации небольшой порции материала из «условно чистых» пиков хроматограммы обнаружить с помощью электрофореза наличие в них минорных компонент, не регистрируемых другим путем. Крупные пептиды, загрязненные примесями, могут быть успешно очищены па ДЭАЭ-целлюлозе, хотя выходы при этом бывают довольно низкими. Поскольку для установления или контроля аминокислотной последовательности крупного пептида, как правило, необходимо проведение дополнительного гидролиза, целесообразно две трети очищенного материала оставить для этих целей. Даже при низком выходе пептида с ДЭАЭ-целлюлозы его количества обычно бывает достаточно для аминокислотного анализа, определения частичной аминокислотной последовательности и проведения дополнительного гидролиза на аналитическом уровне. Полученный гидролизат анализируют методом электрофореза и хроматографии, затем проводят препаративный гидролиз па неочищенном пептиде и фрагменты, принадлежащие главному компоненту, идентифицируют путем сопоставления с аналитической картой.
Таблица 10.5. Ионообменные колонки
|
Общие указания |
Дауэкс-50 |
ДЭАЭ-целлюлоза |
|
Приготовление смолы |
Промывают in situ 1 М NaOH, 1 М HCl и буфером с pH 5,0 (2 М пиридин: 645 мл пиридина + 573 мл ледяной уксусной кислоты + вода до общего объема 4 л). После проверки на отсутствие Na+ в элюенте (по окрашиванию пламени) промывают буфером pH 3,1 (0,2 М пиридин: 64,5 мл пиридина + 1114 мл ледяной уксусной кислоты + вода до общего объема 4 л) до уравновешивания колонки |
Обрабатывают па воронке Бюхнера по прописи изготовителя (промывают 0,2 М NaOH, дистиллированной водой, 0,2 М НCl и снова дистиллированной водой). Оставляют на несколько часов в 10%-ном бикарбонате аммония. Промывают 0,1 %-ным бикарбонатом аммония (pH 8,3) и заполняют колонку. Уравновешивают ионообменник в течение ночи прокачиванием того же буфера со скоростью 100 мл/ч |
|
Тип колонки и размеры |
Колонка высокого давления с водяной рубашкой (9,0 х500 мм) |
Стеклянная пипетка (объем 25 мл) с прокладкой из стеклянной ваты снизу и резиновой пробкой сверху, через которую проходит игла шприца |
|
Температура колонки |
60 °С |
Комнатная |
|
Скорость потока |
15 мл/ч (насос высокого давления, например хроматографический мини-насос фирмы Milton Roy) |
5 мл/ч |
|
Объем фракции, мл |
2 |
2 |
|
Нанесение образца |
Образец растворяют із 1 мл воды с добавлением нескольких капель конц. НСl до pH 2. Отделяют центрифугированием осадок (при помутнении), наносят па колонку продувают азотом и заполняют свободный объем буфером pH 3,1 |
Обессоленный образец растворяют в 2 мл 0,1%-ного бикарбоната аммония (pH 8.3). При необходимости добавляют кристаллическую мочевину для растворения осадка |
|
Промывка 1 |
Промывают буфером pH 3,1 до полного элюирования кислых пептидов (один объем колонки). Контроль: высоковольтный электрофорез на бумаге при pH 6,5 |
Промывают 0,1%-ным бикарбонатом аммония (pH 8,3) до полного элюирования основныx пептидов. Контроль по измерению оптической плотности при 230 нм |
|
Градиент pH буферных растворов |
300 мл буфера pH 3,1+600 мл буфера pH 5,0 (т. е. в соотношении 1:2, в градиентном смесителе) обеспечивают линейный градиент по концентрации ионов пиридина |
Первый градиент: 200 мл 0,1 -ного бикарбоната аммония (pH 8,3)+200 мл 1%-иого бикарбоната аммония (pH 8,3); элюируются основные и нейтральные пептиды. Второй градиент: 200 мл 1%-ного бикарбоната аммония (pH 8,3)+200 мл 3%-ного бикарбоната аммония (pH 8,3); элюируются преимущественно кислые пептиды |
|
Промывка 2 |
Буфер pH 5,6 (8,5 М пиридин: 684 мл пиридина+180 мл ледяной уксусной кислоты+вода до общего объема 1 л) |
50 мл 5%-ного бикарбоната аммония, затем 10 мл 6 М гуанидингидрохлорида. По окончании процесса колонка должна быть приведена к исходным условиям |
Остальные пептиды объединяют и наносят па колонку с дауэксом-50 или несколькими порциями — на ДЭАЭ-целлюлозу.