Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Пептидное картирование белков
Введение
У. Дж. ГУЛЛИК (W. J. GULLICK, Protein Chemistry laboratory, Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, U.K.)
Получение пептидных карт обычно преследует две цели: выяснение структурного сходства молекул белков, выделенных из разных источников, и идентификация изменений в структуре индивидуального белка, возникших в результате нормального или патологического метаболизма. В первом случае эго:
1) Сравнение белков с одной и той же функцией, полученных из различных тканей или организмов.
2) Сравнение продуктов трансляции in vitro с эквивалентными им соединениями, выделенными из клеток.
3) Сравнение субъединиц сложных белков.
Изучаемые с помощью картирования индивидуальные белки в свою очередь можно разделить па две группы: белки, превращающиеся в зрелые клеточные формы по посттрансляционным механизмам (ограниченный протеолиз, гликозилирование, присоединение простатических групп), и белки, претерпевающие обратимые структурные изменения (такие, как фосфорилирование пли ацетилирование), которые могут влиять на их активность.
Пептидное картирование основано на сравнении физико-химических характеристик отдельных пептидов или их смесей, полученных в результате фрагментации белковой молекулы. Для фрагментации может быть использован любой, приводящий к воспроизводимым результатам метод — расщепление пептидных связей протеолитическими ферментами или химическими реагентами. Эффективность пептидного картирования в каждом конкретном случае определяется выбором оптимальных условий разделения и обнаружения смеси фрагментов и достоверной интерпретацией результатов.
Ниже описываются три общепринятых метода разделения пептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что электрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграммой пептидов, полученных из другого белка. Этот метод известен как картирование по Кливленду (по имени первого автора статьи, где он был описан) [12]. В ПААГ в присутствии ДСН могут быть разделены полипептиды с диапазоном молекулярных масс от 103 до 106, но наиболее достоверные результаты получаются при анализе белков с истинными молекулярными массами от 104 до 106, поэтому для белков с молекулярной массой <104 метод обычно не применяется.
Второй метод — двумерное картирование, известное как метод «отпечатков пальцев», (finger printing), он был предложен Ингремом [36, 37] для локализации и последующей идентификации единственного аминокислотного остатка, отличающего полипептидные цепи нормального и серповидноклеточного гемоглобинов. Белок обычно гидролизуют трипсином или а-химотрипсином (Ингрем проводил гидролиз 12 М НСl при 37 °С в течение 2—3 дней), при этом образуется смесь неперекрывающих друг друга коротких (10—20 аминокислот) пептидов. Эта смесь далее разделяется с помощью электрофореза в первом направлении и жидкостной хроматографии — во втором. Пептидные карты — более эффективный способ картирования, чем электрофорез в гелях, поскольку анализируется большое число компонент, образующих определенный набор пятен (рисунок), характерный для каждого индивидуального белка.
В третьем методе, разработанном для картирования пептидов, так же как и в предыдущем, первоначально проводится фрагментация белка на пептиды небольшой молекулярной массы. Далее они разделяются в растворе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе (ОФ-ВЭЖХ) или на ионообменнике (ИО-ВЭЖХ). В первом случае применяют колонки, упакованные смолой па основе силикагеля с «пришитыми» к нему углеводородными цепями различной длины, во втором носителем служит также силикагель, на поверхности которого расположены способные к ионизации группы. Разделение пептидов происходит вследствие различий во времени их удерживания на колонках. Главные преимущества метода заключаются в высокой скорости процесса (время разделения одного гидролизата может составлять <30 мин), чувствительности и получении пептидов в форме, удобной для проведения дальнейшего анализа (определение аминокислотного состава и последовательности). Для определения содержания пептидов измеряется оптическая плотность элюата на одной или нескольких длинах волн, а при работе с радиоактивно меченными препаратами регистрируют радиоактивность (в потоке или в дискретных пробах). Для повышения чувствительности обнаружения в пептиды может быть введена флуоресцентная метка.