Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Триптофан
Определение триптофана в интактном белке

Триптофан в интактном белке может быть определен спектрофотометрически [103, 128, 349], флуорометрически [337] или колориметрически после перевода в окрашенное производное [11, 14, 334, 351]. На ограниченном числе белков были опробованы метод магнитного кругового дихроизма при 293 нм [13] и сцинтилляционный метод с использованием 3-диазо-1,2,4-'[5-¹⁴С]триазола [97]. На пикомольном уровне триптофан был определен по модифицированной реакции Пиктет-Шпенглера: смесь кипятят с феррицианидом калия и формальдегидом, количество образовавшегося 9-гидроксиметил-β-карболина определяют спектрофотометрически или методом ВЭЖХ на обращенной фазе [174].

Триптофан присутствует в белках в наименьших по сравнению с другими аминокислотами количествах, поэтому его тщательный анализ делает возможным прецизионное определение молекулярной массы белка.

3.7.3.1. Определение с 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом [11]

Реагенты

Мочевина, перекристаллизованная из смеси этанол — вода.

2-Гидрокси-5-нитробензилбромид (ГНБ-Вr).

Трихлороуксусная кислота (ТХУ), 50%-ная.

Методика. Анализируемый белок инкубируют при 37° 16—20 ч в 1 мл 10 М мочевины, подкисленной до pH 2,7 концентрированной НСl, охлаждают до комнатной температуры и добавляют (самотеком из пипетки, погруженной в раствор белка) при размешивании на магнитной мешалке 5 мг ГНБ-Вr в 0,1 мл сухого ацетона. Образующийся осадок (в основном продукт гидролиза реагента) удаляют центрифугированием.

Модифицированный белок пропускают через колонку (230X11 мм) с сефадексом G-25 (грубая фракция), уравновешенную 0,18 М уксусной кислотой (pH 2,7) или 10 М мочевиной (pH 2,7). В этих условиях белок остается в растворе. Элюируют со скоростью 100 мл/ч, собирая фракции по 1—4 мл. Белок осаждают 50%-ной ТХУ, добавляя ее в раствор до конечной концентрации 5%. Если использовалась мочевина, то перед добавлением ТХУ раствор разбавляют пятикратным объемом воды. Элюат оставляют при 4 °С на 30 мин или на ночь, образовавшийся осадок отделяют путем центрифугирования, промывают дважды 5 мл раствора этанол — НСl (2 мл концентрированной НСl + 98 мл 95%-ного этанола). В заключение осадок растворяют в 1 мл концентрированной НСl, 0,1 мл этого раствора подщелачивают 2,5 М NaOH до pH 12, доводят общий объем раствора до 2,5 мл. Измеряют поглощение при 410 нм (ем —18 000). Для проведения аминокислотного анализа соответствующие аликвоты гидролизуют 6 М НСl.