Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Остатки амидов дикарбоновых аминокислот
Методики определения амидов

В условиях обычного кислотного гидролиза (6 М НСl) аспарагин и глутамин превращаются соответственно в аспарагиновую* и глутаминовую кислоты. Общее число амидов дикарбоновых аминокислот может быть определено по количеству выделяющегося аммиака в селективных условиях кислотного гидролиза (концентрированная HСl, при 37 °С, 10 сут или 2 М НСl, 100 °С, 2—8 ч). Одновременно происходит незначительное деаминированиe остатков серина, треонина, цистина и триптофана. Порция гидролизата в микродиффузионном аппарате Конвея подщелачивается, и после диффузии в течение ночи аммиак определяется по реакции с нингидрином фотометрическим методом [401]. Глутамин более легко деамидируется, чем аспарагин [32]. Амиды аспарагиновой и глутаминовой кислот могут быть определены раздельно химическим и ферментативным методами [369]. См. обзор [8].

Белки даже после диализа часто содержат свободный аммиак, от которого освобождаются пропусканием раствора белка через колонку с катионообменником в Н⁺-форме.

8.8.1.1. Диффузионный метод [401].

Контрольный опыт. Растворяют 10 мг белка в 1 мл 0,03 М НСl в метаноле и осаждают 2 мл этилового эфира. Центрифугируют. Процедуру повторяют дважды. Осадок сушат в вакууме и количественно переносят во внешнюю камеру диффузионного сосуда Конвея. В центральную часть ячейки помещают 1 мл 0,02 М H₂SO₄. Быстро и осторожно к осадку белка прибавляют 1 мл насыщенного раствора тетрабората натрия, подщелаченного до pH 10,5 2 М NaOH. Крышка сосуда должна быть герметично закрыта с дополнительным грузом сверху. Процесс диффузии проходит в течение ночи при комнатной температуре. Содержимое центральной ячейки переносят количественно в колбу и разбавляют водой до определенного объема. Определяют аммиак реакцией с нингидрином фотометрическим методом.

Амидный азот в белке. Инкубируют 2 мг белка в 1 мл 2 М НСl при 100 °С 2—8 ч; охлаждают и в случае необходимости центрифугируют. Переносят 100—250 мкл раствора во внешнюю камеру сосуда Конвея, как я контрольном опыте, но используют более концентрированный боратный буфер (15 мг борной кислоты в 100 мл 2 М NaOH). На каждое измерение требуется —0,2 мкмоль NH₃. Строят график зависимости количества выделившегося NH3 от времени и определяют величину отрезка, отсекаемого при» экстраполяции к нулевому времени.

8.8.1.2. Диффузионный метод с тринитробензолсульфокислотой [399].

Реагенты.

2,4,6-Тринитробензолсульфокислота (ТНБС) перекристаллизована из 1 М НСl в воде [110].

Раствор ТНБС (1,1 М; 100 мг/200 мл воды) используют свежеприготовленный. Хранят замороженным в темноте.

Сульфат аммония («для анализа», фирма Merck) сушат 3 ч при 100 °С и храпят в эксикаторе над силикагелем.

Борная кислота, 0,1%-иый раствор (масс./об.).

Na₂B₄O7, насыщенный водный раствор.

A. 0,1 М Na₂SO₃; готовится ежедневно.

Б. 0,1 М NaH₂PO₄.

B. 0,1 М Na₂B₄O₇ в 0,1 М NaOH.

Г. 1,5 мл А+98,5 мл Б (готовится ежедневно).

Методика. Гидролизуют белок 10 М НСl при 37 °С 10 сут. Гидролизат помещают во внешнюю камеру диффузионного сосуда Конвея и добавляют воду, чтобы общий объем составил 1,5 мл. В центральную ячейку наливают 0,9 мл 0,1%-ной борной кислоты. Наносят смазку па крышку камеры, слегка приподнимают се и быстро добавляют 3 мл насыщенного раствора тeтрабората натрия, подщелаченного до pH 10,5 2 М NaOH. Плотно закрывают камеру и сверху крышки кладут груз. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, затем количественно переносят содержимое центральной ячейки во взвешенную пробирку и добавлением воды доводят массу раствора до 1,5 г. Из такого объема можно взять три пробы для анализа по методике Филдса [110], описанной ниже; чувствительность 6 нмоль. Одновременно находят содержание воды и сульфата аммония.

Методика Филдса. Образец вносят в 0,5 мл реагента В и доводят объем до 1,0 мл. Добавляют 0,02 мл раствора ТНБС и быстро перемешивают. Через 5 мин останавливают реакцию, приливая 2 мл раствора Г. Измеряют поглощение при 420 нм.

8.8.1.3. Аминокислотный анализатор [173]. Гидролизуют 2—3 мг белка в 1 мл иодоводородной кислоты (кипящей при постоянной температуре; содержащей 0,03% гипофосфорной кислоты) (BDH-MAR); гидролиз проводят в запаянной вакуумированной ампуле при 107 °С (термостат с принудительной циркуляцией воздуха) в течение 1,5 ч для растворимого и 2 ч для нерастворимого белка. Можно использовать и другие условия: 2 мл 2 М НСl, 110 °С, 2 и 14 ч. Гидролизат разбавляют 5 мл 0,1 М НСl и наносят на колонку (75X9 мм) со смолой аминекс А-5 аминокислотного анализатора фирмы Beckman. Реальное количество аммиака, образовавшегося из амидных групп, определяют вычитанием из полученной величины пика соответствующих значений, найденных в глухом (без гидролиза белка) эксперименте.

Таким образом с использованием 1,5 мг белка для гидролиза и 2,5 мг для контрольного опыта был определен единственный остаток амида дикарбоновой аминокислоты в белке с молекулярной массой 7000. Гидролиз иодоводородной кислотой и микрометод Кьельдаля дали сравнимые результаты. Аналитическая колонка должна иметь сверху слой смолы в 1 см, расположенный на тефлоновой прокладке для задерживания негидролизованного белка. Эта часть смолы (с прокладкой) удаляется перед подачей на колонку раствора NaOH и затем регенерируется нагреванием при 70 °С с 12 М серной кислотой.

8.8.1.4. Бис(1,1-трифтороацетокси)иодобензол [345].

Реагент

Бис(1,1-трифтороацстокси)иодобензол (БТИ) может быть приготовлен по методике, описанной в работе [287]. Растворяют при слабом нагревании 5,0 г фeнилиодозилацетата (фирма Aldrich) в 25 мл безводной ТФУ и оставляют стоять при комнатной температуре 1 ч. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток пeрекристаллизовывают из смеси гексан-ТФУ. Температура плавления 123—126 °С. Хранят в темной склянке при —20 °С.

Методика. Разрушение карбоксиамидных групп. Раствор 200 мкг белка в 2 мл 0,01 М ТФУ или 5 М гуанидин∙НСl — 0,01 М ТФУ смешивают с 2 мл свежеприготовленного БТИ в диметилформамиде (36 мг/мл). Ампулу вакуумируют и запаивают; нагревают при различных температурах (35, 60 и 110 °С) в течение увеличивающихся периодов времени (4 и 18 ч). Удаляют избыток реагентов диализом против воды (мембрана типа Spectrapor 3). Экстрагируют диализованный образец три раза равным объемом н-бутилацетата. Лиофилизуют. Гидролизуют 6 М НСl в вакууме при 110 °С 24 ч.

Аспарагин превращается количественно в 2,3-диамннопропионовую кислоту, а глутамин — в 2,4-диаминомасляную кислоту. Эти кислоты обычно не отделяются от лизина на аминокислотном анализаторе, поэтому содержание амидов в белке определяется дифференциальным методом, т. е. находят содержание Asp и Glu в образцах без обработки белка БТИ и после такой обработки. Некоторые аминокислоты (Cys, His, Lys, Met и Thr) затрагиваются при реакции с БТИ.

8.8.1.5. Ферментативный гидролиз и газожидкостная хроматография [150].

Ферментативный гидролиз. 0,2 мкмоль пептида в 0,2 мл 0,05 М NH₄HCO₃ (pH 8,0) гидролизуют проназой (1% по массе) 24 ч при 37 °С. Затем продолжают гидролиз еще 17 ч, добавив 4% (по массе) аминопептидазы М. Лиофилизуют.

Газожидкостная хроматография. Смесь аминокислот в сосуде с завинчивающейся пробкой с тефлоновым вкладышем обрабатывают 0,2 мл 1,25 М НСl в н-бутанолt при 100 °С в течение 7 мин. Реакционную смесь охлаждают во льду и сушат в потоке азота. Затем проводят ацилирование, для этого к остатку добавляют 0,1 мл трифтороуксусного ангидрида в метиленхлориде (1:3) и нагревают смесь 20 мин при 100 °С. Производные аминокислот разделяют на колонке (1,5 мХ4 мм) с хромосорбом О. В качестве внутреннего стандарта используют н-бутилстеарат, содержащий 0,325% (по массе) этиленгликольадината. Приведенные условия этерификации должны строго соблюдаться во избежание возможного частичного превращения амидов в аспарагиновую и глутаминовую кислоты.