Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Триптофан
Определение триптофана после кислотного гидролиза белка

8.7.2.1. Методики.

Методика 1. Использование НСl с добавкой тиогликолевой кислоты [246]. Гидролизуют белок со свежеприготовленной 6 М НСl, содержащей 4% тиогликолевой кислоты, при 108—110 °С 24—64 ч. Выход Тrр ~90%. Выходы других аминокислот, за исключением пролива, не меняются. Углеводы в небольших количествах не мешают анализу; в то же время при 50-кратном молярном избытке глюкозы Тrр в белке не был обнаружен.

Методика 2. Использование n-толуолсульфокислоты [223]. n-Толуолсульфокислоту перекристализовывают из соляной кислоты и тщательно освобождают от НСl путем высушивания в вакууме при 45 °С над NaOH (гранул.) (тест на отсутствие ионов хлора — реакция с 1%-ным раствором AgNO₃в 50%-ной NHO₃).

Гидролизуют 2—4 мг белка в 1 мл 3 М n-толуолсульфокислоты, содержащей 0,2% (маес./об.) 3-(2-аминоэтил)индола, смесь вакуумируют (2∙10^-2—3∙10^-3 мм рт. ст.) при 110 °С в течение 24, 48 или 72 ч. Охлаждают, добавляют 2 мл 1 М NaOH, доводят объем до 5 мл, фильтруют и берут аликвоту на анализ. Одновременно с триптофаном определяются и другие аминокислоты. Образец должен содержать не более 2 мг углеводов.

Методика 3. Использование меркаптоэтансульфокислоты [292]. Гидролизуют белок в 1 мл З М меркаптоэтансульфокислоты при 110°±2°С 24 и 72 ч. Охлаждают, добавляют 2 мл 1 М H₂SO₄и количественно переносят в 5 мл колбу.

Замечание. Эта методика приводит к выходам лучшим, чем методика 1, и почти таким же, как методика 2. В химотрипсине после 22- и 72-часового гидролиза найдено 96 и 91% Тrр соответственно. Методика рекомендуется только для чистых белков.

Методика 4. Использование метансульфокислоты [343]. 4 М метансульфокислоту готовят разбавлением концентрированной кислоты с добавкой твердого 3-(2-аминоэтил)индола до концентрации 0,2% (масс./об.). Реагент продувают азотом и хранят при 4 °С. Препарат поставляет фирма Pierce. Белок (0,2—2,0 мг) гидролизуют в вакууме (2∙10^-2 мм рт. ст.) при 115 °С, 22, 48 и 96 ч в 1 мл метансульфокислоты (0,3 мл при количестве образца <1 мг). Частично нейтрализуют 3,5 М NaOH, доводят до определенного объема. Центрифугируют или фильтруют перед нанесением на колонку анализатора.

Замечание. Потери Тrр (3,2%), Thr (5,9%), Ser (9,6%) меньше, чем в методике 2. Однако при содержании углеводов в белке >20% потери Тrр становятся значительными и его количественное определение невозможным [172].