Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Триптофан
Определение триптофана после щелочного гидролиза белка
В условиях кислотного гидролиза соляной кислотой триптофан практически полностью разрушается, особенно если белковая молекула содержит углеводные компоненты. Были предприняты попытки получить лучшие результаты; для этого к НСl добавляли тиогликолевую кислоту или соляную кислоту заменяли на n-толуолсульфокислоту, метансульфокислоту или меркаптоэтан- сульфокислоту (см. методики в разд. 8.7.1).
Наилучшие результаты по триптофану дает альтернативный кислотному щелочной гидролиз, однако при этом молярные соотношения аминокислот должны рассчитываться из данных независимых анализов кислотных гидролизатов [168]. При проведении щелочного гидролиза щелочную среду создают с помощью Ва(ОН)2 [318], NaOH [168] и LiOH [226]. В качестве внутреннего стандарта используют 5-метилтриптофан; по его выходу вносят поправку на деструкцию триптофана [404], следует иметь в виду, что на некоторых колонках 5-метилтриптофан элюируется совместно с лизиноаланином, образующимся в процессе щелочного гидролиза [419].
8.7.1.1. Методики.
Методика 1. Использование NaOH [168].
Реагенты. Продажный частично гидролизованный крахмал (50 г) промывают ацетоном, сушат и используют в качестве антиоксиданта.
1-%ный октиловый спирт в толуоле для подавления вспенивания.
50%-ный NaOH (масс./об.) разбавляется непосредственно перед употреблением.
Методика. К 1—5 мг белка в полипропиленовой центрифужной пробирке (109X5,0 мм) добавляют 25 мг крахмала, 0,5 мл 4,25 М NaOH (или 0,1 мл раствора белка и 0,5 мл NaOH) и 5 мкл 1%-ного октилового спирта. Пробирку помещают в запаянную с одного конца трубку из пирекса; верхнюю часть трубки оттягивают в пламени газовой горелки (без нагревания пластикового вкладыша). Нижнюю часть этой незапаянной еще ампулы с центрифужной пробиркой охлаждают в бане (ацетон + «сухой» лед), не замораживая содержимого. Ампулу вакуумируют до остаточного давления <5∙10-2 мм ртутного столба и запаивают. Нагревают при 110 °С обычно в течение 16— 24 ч или более (до 96 ч); если в белке имеются связи Ilе-Тrр или Val-Trp, тo гидролиз ведут при 135 °С в течение 48 ч.
Охлажденную пробирку осторожно открывают, добавляют 0,5 мл 0,20 М Na-цитратного буфера (pH 4,25). Раствор с помощью пастеровской пипетки переносят (с последующими промывками) в мерную колбу объемом 5 мл, содержащую 420 мкл 6 М HCl, охлажденной в «сухом» льду. Доводят объем до 5 мл нитратным буфером.
Замечание. Триптофан анализируют на короткой катионообменной колонке (80X9 мм) [267] с Na-цитратным буфером (pH 5,4). Нейтральные и кислые аминокислоты выходят с колонки вместе за 20 мин, триптофан — на 35-й минуте, лизиноаланин (образующийся во время щелочного гидролиза) на 53-й минуте; затем элюируются Lys (65 мин), His (80 мин) и NН3 (95 мин). Причиной того, что для анализа не применяют обычный буфер с pH 2,2, является частичная потеря (10%) Тrр при 25 °С. Выходы триптофана составляют 100±3%.
Методика 2. Использование LiOH [226]. Для гидролиза белка используют пробирки с завинчивающейся пробкой с тефлоновым вкладышем (1 мл 4 М LiOH на 25 мг образца). Пробирку с образцом продувают азотом, замораживают и бане с ацетоном и «сухим» льдом и плотно закрывают. Гидролизуют в течение 20 ч при 110 °С или 4 ч при 145 °С, что дает приблизительно одинаковые результаты. Гидролизат охлаждают и нейтрализуют 85%-ной оргофосфорной кислотой; доводят до определенного объема. Аликвоту разбавляют 0,2 М фосфатным буфером (pH 7,0) для анализа.
Замечание. Экстраполяция к нулевому времени гидролиза показала, что за 4—8 ч при 145 °С разрушается ~5% Тrр. При сравнении двух методик щелочного гидролиза найдено, что лучшие результаты дает применение LiOH.