Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Методы окрашивания белков в гелях
Методы окрашивания белков красителями

Окрашивание белков в гелях с помощью красителей уступает по чувствительности описанным выше методикам с применением комплексов серебра, по его проще осуществлять в повседневной практике. Наиболее широко используется краситель кумасеи бриллиантовый голубой, по существует и много других модификаций метода. Окрашенные кумасси полосы белков могут быть сфотографированы при освещении лампой дневного света на поляроидную пленку типа 665 (фокусное расстояние 32, экспозиция 0,5 с) с желтым светофильтром [353].

1. Окрашивание ПААГ красителем кумасси R250 (0,1%, масс./об., фирма Serva) в смеси 50%-ный метанол — 12%-ная уксусная кислота в течение ночи при легком помешивании. Обесцвечивание несколькими объемами раствора 10%-ный этанол — 5%-ная уксусная кислота. Фотографирование через узкополосный (550 нм) интерференционный светофильтр (фирма Baird Atomie, Bedford, MA) [253]. При электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСП белков, прочно связанных с ДНК, были обнаружены две артефактные полосы (соответствующие молекулярным массам 54∙10³ и 68∙10³), окрашиваемые кумасси и комплексами серебра; в буфере присутствовал меркаптоэтанол [364].

2. Окрашивание ПАА-гелей в течение ночи кумасси R250 (0,2% масс./об.) в смеси 45%-ный метанол — 10%-ная уксусная кислота, обесцвечивание раствором 10%-ный метанол — 7%-ная уксусная кислота [317]. После электрофореза агарозные гели смачивались дистиллированной водой, обертывались фильтровальной бумагой и выдерживались 30 мин при 37 °С. Окраска проявлялась через 15 мин после обработки кумасси R250 (0,1%, масс./об.) в смеси 45%-ный этанол — 10%-ная уксусная кислота. Обесцвечивание той же смесью растворителей.

3. Обнаружение с помощью кумасси белков и полипептидов после изоэлектрофокусирования [370]. Кумасси бриллиантовый голубой R250 не может быть использован в обычных условиях для обнаружения белков на ПААГ после изоэлектрофокусирования, поскольку носители-амфолиты (полиаминополикарбоновые кислоты) реагируют с красителем. Для преодоления этих ограничений было предложено использовать коллоидные суспензии кумасси R250 и G250 в хлорной [311] и трихлороуксусной [26, 313] кислотах. Приведенная ниже методика дает хорошие результаты.

После изоэлектрофокусирования полосу геля толщиной 0,5 мм опускают на 3 ч в водный 0,15%-ный раствор кумасси G250, содержащий 40% метанола и 4% формальдегида. Обесцвечивают в течение ночи 10%-ным метанолом путем смены нескольких объемов промывного раствора. Слабый голубой фон остается, но он не мешает определению. Фотографируют при освещении лампой дневного света на поляроидную пластинку типа 665 с оранжевым светофильтром, фокусное расстояние 8, экспозиция 1/8 с.

Метод применим к ПААГ-системам, содержащим ДСН и 8 М мочевину. Полипептиды и белки (М 1665—68 000) с изоэлектрическими точками при pH 2,2—10,2 были разделены изоэлектрофокусированием в градиенте pH 3,5—10,5. Чувствительность обнаружения для тридекапептида а-меланостимулирующего гормона составила 20 мкг.

4. Окрашивание кумасси в процессе электрофореза [379].

Метод позволяет осуществить окрашивание в процессе электрофореза в кислых гелях и применялся в основном для обнаружения гистонов. Добавляют кумасси R250 (0,01%, масс./об.) к катодному буферу и ведут электрофорез в 0,9 М уксусной кислоте (pH 2,5) при нагрузке 4 мА на одну гелевую трубку и 100 В до достижения красителем верхнего края геля. Обесцвечивают в течение короткого времени (2—3 ч) для обнаружения минорных полос.

5. Для обнаружения гистонов на ПААГ была использована следующая методика.

Перед окрашиванием солями серебра погружают гель на 3 ч в 500 мл раствора, содержащего 1% амидочерного, 40% метанола и 7% уксусной кислоты. Обесцвечивают в течение ночи в 4 л смеси 32%-ный этанол—18%-ная уксусная кислота и затем промывают 4 раза по 1 л воды [259].

В альтернативном варианте при легком размешивании выдерживают гель в течение 3 ч (не более) в растворе, содержащем 0,05% 2,7-нафталиндисульфокислоты (фирма Eastman), 50% метанола и 10% уксусной кислоты. Обесцвечивания не требуется.