Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Введение

Р. М. ХЕУИК (R. М. HEWICK, Genetics Institute, 225 Longwood Avenue, Boston, Massachusetts 02115, U.S.A.), M. У. ХАНКАПИЛЛЕР (M. W. HUNKA- PILLER, Applied Biosystems Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404, U.S.A.)

Автоматическое определение аминокислотной последовательности пептидов и белков по Эдману чаще всего проводят на жидкофазном (ЖФ) секвенаторе с вращающимся реактором [2]. В последние годы существенно усовершенствованы и ЖФ- секвенатор, и методы работы на нем [6, 9, 14—16]. Уделяя особое внимание тщательной очистке реагентов и растворителей, используемых как в секвенаторе, так и в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) отщепленных производных аминокислот, в настоящее время можно определять протяженные последовательности аминокислот (>30 остатков), располагая количествами пептида (белка) <1 нмоль [7]. Основной недостаток ЖФ-анализа связан с вымыванием образцов, особенно гидрофобных пептидов. Применение полибрена* при анализе последовательности на ЖФ-секвенаторе помогло решить эту проблему [6, 14].

Для устранения потерь с промывками образца был предложен твердофазный (ТФ) метод анализа [11]. Благодаря ковалентному присоединению изучаемого полипептида к химически модифицированной матрице носителя (на основе стекла или полистирола) исключены потери образца при промывке его органическими растворителями в процессе отщепления аминокислот. Простота конструкции колонки-реактора ТФ-секвенатора облегчает ее миниатюризацию, что позволяет повысить чувствительность определения последовательности. В то же время ковалентное присоединение пептидов и белков к носителю в гетерогенной системе не так просто осуществить, а выходы на этой стадии составляют лишь 20—50%. Реакции связывания белка (пептида) с матрицей носителя проводятся вне секвенатора, они весьма трудоемки и требуют длительного времени. Необходимо отметить, что планирование эксперимент по ковалентному присоединению полипептида до некоторой степени зависит от знания его аминокислотного состава. Существенный недостаток ТФ-метода заключается в том, что из-за пропусков аминокислот в местах связывания полипептида с матрицей получают недостаточно полную информацию об аминокислотной последовательности пептида; кроме того, образец полностью теряется (вымывается из колонки) в случае, когда очередная отщепляемая аминокислота оказывается последней точкой присоединения пептида к носителю.

* Полибрен — 1,5-диметил- 1,5-диазаундекаметиленполиметобромид. — Прим. перев.

Недавно был разработан миниатюрный секвенатор нового типа — газофазный, в котором для проведения реакции Эдмана используются газообразные реагенты [4, 8]. Единственными жидкостями, вступающими в контакт с пленкой белка (пептида), являются фенилизотиоцианат и органические растворители, в которых белок плохо растворим. Вымывание гидрофобных пептидов и белков, связанных с додецилсульфонатом натрия (ДСН), предотвращают добавлением полибрена.

Изучаемый пептид наносят на пористый фильтр, который затем высушивают; таким образом получают тонкую пленку образца в реакционной камере ГФ-секвенатора. Пептид очень прочно связан с фильтром, даже не будучи ковалентно присоединенным к нему. Поскольку образец находится в одном и том же физическом состоянии в течение всего процесса определения по Эдману, то вместо громоздкой и сложной в изготовлении системы с вращающимся реактором используют миниатюрный реакционный сосуд проточного типа. Уменьшение размеров реактора ведет к дальнейшему снижению расхода изучаемого материала по сравнению с ЖФ-секвенатором [7]. При работе на ГФ-секвенаторе требуется значительно меньше реактивов, расщепление по Эдману проходит быстрее; конструктивно ГФ-секвенатор устроен проще, чем ЖФ-прибор.

В этой главе рассмотрены наиболее важные конструкционные особенности ГФ-секвенатора, особенности методик, с успехом применяющихся для анализа структуры на микроуровне (<100 пмоль) пептидов, элюированных из ДСН-полиакрил-амидных гелей (ДСН—ПААГ).