Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Количественное определение белка
Спектрофотометрические методы
8.18.8.1. Сравнение поглощения при 280 и 260 нм. Большинство белков имеет максимум поглощения при 280 им, что обусловлено содержанием в них остатков триптофана и тирозина. Нуклеиновые кислоты, присутствующие часто в виде примесей к белкам, также сильно поглощают при 280 нм, но максимум поглощения этих соединений находится при 260 нм. Барбург и Христиан экспериментально определили коэффициенты экстинкции различных белков и нуклеиновых кислот при 280 и 260 нм и нашли отношение этих коэффициентов (фактор F; табл. 8.3); предложен дифференциальный метод определения белка в интервале концентраций 50—500 мкг/мл.
Метод Варбурга и Христиана [388]. Измеряют оптическую плотность белкового раствора при 280 нм и 260 нм. Вычисляют отношение полученных величин, по табл. 8.3 находят соответствующее значение F и подставляют в следующую формулу:
Концентрация белка (мг/мл) = F∙1/d∙A280 [где d — длина кюветы (в см)] или [212]:
Концентрация белка (мг/мл) = 1,55A260 — 0,7бA260
8.18.8.2. Сравнение поглощения при 230 и 260 нм [194].
Концентрация белка (мкг/мл) = 183A230 — 75,8A260
Эти длины волн были выбраны потому, что они соответствуют минимальному и максимальному поглощению в спектре нуклеиновых кислот. Небольшие отклонения в установке длины волны практически не оказывают влияния на определение нуклеиновых кислот, но поглощение белков при —230 им меняется на 1% при изменении длины волны па 0,1 нм. Высокие концентрации сульфата аммония, глицерина, сахарозы, мешающие определению в методе Лоури, можно нивелировать соответствующими добавками в «холостом» опыте.
8.18.8.3. Сравнение поглощения при 235 и 280 нм [399].
Концентрация белка (мг/мл) = (A235—A280)/2,51
Замечание. Нуклеиновые кислоты нс дают вклада в результаты, поскольку имеют одинаковое поглощение при 235 и 280 нм. На основе данных аминокислотного состава 208 белков была найдена средняя суммарная величина поглощения остатков Тrр, Туr, Phe, His, Met, Cys-Cys и Cys, она составила 0,853, а для 8 изученных белков — 0,849.
Чувствительность определения концентрации белка при A233 в 2,82 раза выше, чем при A280). Чувствительность метода в целом составляет 45% таковой для метода Лоури.
Еще один метод определения основан на измерении величины отношения А233/A240 [133].
8.18.8.4. Сравнение поглощения при 215 и 225 нм [383]. Делают серию разбавлений раствора белка и измеряют поглощение образцов.
Концентрация белка (мкг/мл) = (A215 — A225) ∙ 144
Замечание. NaCl и (NH4)2SO4 не мешают определению [271], некоторые буферы, например ацетатный, цитратный, барбитуратный, сукцинатный, фталатный, сильно поглощают при 215 нм, но могут быть использованы в низкой концентрации (0,005 моль/л), если при этом делается поправка на контрольный опыт. Критическая оценка метода дана в работе [407]; он рекомендован к использованию как для чистых белков, так и для смесей в диапазоне концентраций 1,5—45 мкг/мл, где сохраняется линейная зависимость.
8.18.8.5. Сравнение поглощения при 280 и 205 нм [335]. Раствор белка разбавляют 0,1 М K2SO4, содержащим 5 мМ КН2РО4, с pH 7,0 (добавление КОН). Поглощение этого буфера при 205 нм составляет 0,08 ед. опт. пл./см и зависит от содержания СО2. Адсорбционные потери белков сводятся к минимуму при приготовлении растворов в полиэтиленовых сосудах. Кварцевые кюветы должны быть очищены концентрированной азотной кислотой и сделана соответствующая поправка на светорассеяние в дальнем ультрафиолете.
Наибольший вклад в поглощение при 205 нм дают боковые цепи остатков Тrр, Туr, Phe, His и в меньшей степени остатки Arg, Met и Cys. Поправка для Тrр и Туr (для других аминокислот в большинстве случаев этого не делают) определяется путем измерений (па образце с большей концентрацией) поглощения при 280 им.
ε205 = 27,0 + 120 ∙ (А280/А205)
Замечание. При количественном определении 12 белков спектрофотометрическим методом найдено ε280 = 0,50:2,65 и ε205 = 29,0:36,4. Лишь в случае необычно высокого содержания Phe в образце ошибка измерения достигала более ±2% [335].
Для анализа белков при 205 нм требуется спектрофотометр высокого класса и следует иметь в виду, что из раствора должны быть исключены даже следовые количества соединений, поглощающих в этой области (НСООН, СH3СООН, СН3СОСН3 и др.).