Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с высокой специфичностью
Постпролинспецифичный фермент
Поскольку остаток пролина в структурном отношении принципиально отличается от других аминокислотных остатков и вместе с тем относится к природным аминокислотам и входит в состав многих белков, можно было рассчитывать, что в природе существует фермент, расщепляющий соответствующие пептидные связи. Подобный фермент представлял бы несомненный интерес, поскольку пролин — редкая аминокислота и его присутствие ограничивает возможность атаки соседних пептидных связей другими протеолитическими ферментами. До настоящего времени выделен только один постпролинспецифичный фермент [54]. Выделение и очистку этого фермента из почек ягненка проводили методом аффинной хроматографии. По предварительным данным фермент относится к классу сериновых протеаз [123]. Подробная характеристика фермента приведена в работах [109, 124]. Фермент не выпускается в виде коммерческого препарата.
3.5.8.1. Специфичность и условия гидролиза. На примере гидролиза коротких пептидов, содержащих не более 13 аминокислотных остатков, показано, что фермент гидролизует все типы связей -Рrо-Х- за исключением -Pro-Pro- [54]. Скорость гидролиза зависит от природы остатка X: максимальная скорость наблюдается, если X обладает гидрофобными свойствами, минимальная при кислотных или основных свойствах. Показано также, что фермент гидролизует связи -Ala-X-, но скорость гидролиза составляет 1/100 : 1/1000 скорости гидролиза связи -Pro-Х-. При инкубации октапептида наблюдался ограниченный гидролиз связи -Pro-Thr- [20], в то время как обработка 22- и 33-членных пептидов в течение 36 ч приводила к расщеплению только 10—20% связей, чувствительных к действию фермента [23]. Полученнные данные свидетельствуют о том, что фермент можно использовать только для гидролиза коротких пептидов.
Условия гидролиза. Фермент проявляет максимум активности в диапазоне pH 7,5—8,0. Гидролиз проводят в 100 мМ NH4HCO3 (pH 7,8), содержащем 1 мМ ДТТ и 1 мМ ЭДТА при 22 °С в течение 24 ч.