Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аффинная хроматография белков
Адсорбция и элюирование

Перед использованием аффинного сорбента рекомендуется отмыть его от 0,02%-ного азида натрия, который обычно добавляется в коммерческие препараты для предотвращения биодеградации носителя. Примеси белков или свободного лиганда удаляют кратковременной промывкой 1 М раствором уксусной кислоты с последующей тщательной промывкой обычным нейтральным буферным раствором. Перед нанесением образца на колонку необходимо определить специфическую активность исследуемого белка. Концентрацию белка целесообразно определять с помощью иммунохимического метода, например иммуноферментным или радиоиммунным анализом.

Как правило, выделение и очистку мембранных белков проводят в присутствии детергентов. Присутствие дигитонина или додецилсульфата натрия в небольших концентрациях не влияет на эффективность аффинной хроматографии. Однако в каждом конкретном случае необходимо учитывать влияние детергента на процесс сорбции, элюирования и особенно на метод определения биологической активности, применяемый до нанесения образца на колонку. Использование буферных растворов, не содержащих детергентов, может привести к неспецифической сорбции белка на сорбенте вследствие его агрегации, что существенно повлияет на степень очистки.

После нанесения образца колонку промывают сначала нейтральным буферным раствором, затем З М раствором NaCl. В полученных фракциях определяют биологическую активность. Следует по возможности избегать разведения полученных при промывке фракций, так как в них может быть обнаружено исследуемое вещество. Причиной этого может быть насыщение колонки или неудачно выбранные условия нанесения. В этом случае полученные фракции повторно наносят на колонку в тех же или иных условиях.

Существенным фактором при подборе условий элюирования является выбор состава элюента для десорбции связанного белка. В качестве элюента можно например, использовать свободный лиганд. Однако на практике этот вариант десорбции встречается достаточно редко ввиду низкой растворимости лигандов в водном буфере или ввиду высокой стоимости лиганда. Кроме того, в случае неспецифической сорбции элюирование свободным лигандом может привести к ошибочным результатам. Более эффективную десорбцию обеспечивают лиганды иного строения, но с аналогичной специфичностью. В качестве элюентов обычно используют ингибиторы или кофакторы ферментов, гаптены, соответствующие фрагментам антигена, иммобилизованного на сорбенте, антагонисты рецепторов гормонов и т. д.

В некоторых случаях для разделения белковых компонентов, характеризующихся различным сродством к аффинному сорбенту, используют элюирование в линейном или ступенчатом градиенте возрастающей концентрации элюента. Для десорбции белков, обладающих сильным сродством к сорбенту благодаря гидрофобным, электростатическим или другим взаимодействиям, рекомендуется вести элюирование в более жестких условиях, например, 1 М уксусной кислотой, 6 М мочевиной, 4 М гуанидин-НСl или 2 М роданидом железа. Однако в указанных условиях наблюдается десорбция неспецифически связанных белков, а также денатурация исследуемого белка и потеря его биологической активности. В таком случае следует использовать иммунохимические методы идентификации. Другой недостаток элюирования в жестких условиях касается снижения общего числа хроматографических циклов, которые можно выполнить на данном аффинном сорбенте. Если белки элюируют в сильно денатурирующих условиях, то образец немедленно отделяют от денатурирующей смеси путем диализа. При десорбции в кислотных условиях используют минимальное количество кислоты, а фракции либо немедленно нейтрализуют, либо отбирают в пробирки с рассчитанным количеством нейтрального концентрированного фосфатного буфера.

Для оценки эффективности аффинной хроматографии существенное значение имеет выход исследуемого белка на каждой стадии элюирования. В связи с этим все полученные фракции сохраняют до окончания эксперимента. Выход исследуемого белка может варьировать в широком диапазоне. Добавление белка-носителя приводит к увеличению выхода биологически активного материала, но может также повлиять на степень очистки. При вымывании лиганда с сорбента наблюдается уменьшение выхода сорбированного белка или кажущегося выхода выделяемого биологически активного материала. Степень отщепления лиганда оценивают по содержанию лиганда во фракциях, полученных при промывке сорбента до нанесения образца [8], или по отщеплению радиоактивной метки при использовании радиоактивно меченных лигандов.

Присутствие в образце лиганда протеаз может препятствовать определению биологической активности исследуемых белков. Влияние лиганда можно исключить либо разбавлением образца, либо исчерпывающим диализом. Однако на этой стадии может возникнуть опасность денатурации белка. С целью предотвращения деградации белка все операции, включая нанесение, сорбцию, промывку и элюирование, проводят в присутствии ингибиторов протеаз.