Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Определение белка с помощью реактива Фолина - Чикольте

8.18.2.1. Метод Лоури [2251

Реагенты.

A. 2%-ный (масс./об.) раствор Na₂CО₃ в 0,10 М NaOH.

Б. 0,5%-ный раствор CuSО₄-5H₂О в 1%-ном N_a- или К-тартрате.

B. Щелочной раствор меди. Смешивают 50 мл реагента A и 1 мл реагента Б (пригоден в течение 2 сут).

Г. Смешивают 50 мл 2%-ного (масс./об.) раствора Na₂CO₃ с 1 мл реагента Б (годен в течение 1 сут).

Д. Реагент Фолина — Чикольте. После приготовления надо использовать в тот же день; в настоящее время доступен комерческий препарат с более длинным сроком использования (хранение при 0—4°С). Титруют аликвоту реагента до pH 10,0 (по фенолфталеину) и на основании результатов титрования разбавляют реагент приблизительно в два раза до концентрации 1 моль/л.

Белок-стандарт. Готовят раствор БСА или другого очищенного белка с концентрацией 500 мкг/мл. В пробирки вносят с помощью пипетки порции раствора 10 мкл — 200 мкл (5 мкг—100 мкг) и разбавляют водой до 200 мкл.

Методика. В 3—10-миллилитровую пробирку вносят пипеткой 0,2 мл раствора белка (5—100 мкг) и приливают 1 мл реагента В. Смешивают на вибраторе и оставляют стоять на 10 мин. Быстро добавляют 0,10 мл реагента Д, перемешивают (общий объем 1,3 мл). Выдерживают 30 мин или немного дольше и измеряют поглощение против пробы «холостого» опыта. Находят концентрацию по градуировочному графику. Могут быть использованы любые кратные количества указанных объемов.

Если белок находится в разбавленном растворе (~25 мкг/мл), то на анализ берут 0,5 мл раствора образца, добавляют 0,5 мл реагента В, имеющего концентрацию в 2 раза выше, и 0,1 мл реагента Д.

При плохой растворимости белка в 0,1 М щелочном растворе реагента А к пленке высушенного белка (5—100 мкг) добавляют 0,1 мл 0,1 М NaOH, при необходимости нагревают. Затем к раствору приливают 1 мл реагента Г и через 10 мин — 0,1 мл реагента Д.

Замечание. Интенсивность окраски определяется природой белка, и ее зависимость от концентрации лишь приблизительно линейна в диапазоне 15—40 мкг белка (30—80 мкг при увеличении вдвое объемов реагентов). Методика проста, дает воспроизводимые результаты и достаточно чувствительна (~0,2 мкг белка). С помощью несложных операций градуировочный график для концентрации белка вплоть до 1,0 мг можно преобразовать в линейный [75].

Разработано несколько модификаций методики, чтобы исключить возможность ошибок из-за наложения фона примесей небелкового характера. Во многих случаях ошибки удается уменьшить путем внесения соответствующего соединения как в раствор стандартного белка, так и в контрольный («холостой») опыт.

Присутствие ДСН не оказывает влияния на реакцию [216], а меркаптоэтанол должен быть удален полностью перед добавлением реагента (обычно это делается тщательной сушкой образца в вакууме) [238]. От таких соединений, как катехоламины, также дающие окрашивание, белок должен быть предварительно освобожден осаждением трихлороуксусной кислотой [165, 279, 421]. Описана модифицированная процедура с использованием хлорамина-Т для растворов белков, содержащих пурины и/или сульфгидрильные соединения [157—159].

Опубликован обширный обзор, где рассмотрено влияние на определение белка по методу Лоури примесей различных соединений: пуринов, глицина, гидразина, сульфата аммония (при конечной концентрации >0,15%) и фенола [299].

8.18.2.2. Упрощенный метод Лоури. Модификация Петерсона [298].

Реагенты.

1) Тартрат-карбонат меди (ТКМ). Медленно при перемешивании добавляют 20%-ный раствор карбоната натрия к раствору сульфата-тартрата меди до получения конечного раствора следующего состава: 0,1% CuSO₄∙5H₂O + 0,2% тартрата калия+10% карбоната натрия. Раствор стабилен в течение 2 мес при 20 °С.

2) 0,8 М NaOH.

3) 10%-ный раствор ДСН (фирмы Sigman и Pierce).

4) Реагент Фолина—Чикольте (2 моль/л).

Рабочие растворы.

1) 0,15%-ный дезоксихолат натрия (ДОХ).

2) 72%-ная ТХУ,

3) БСА, 0,5 мг/мл. Срок хранения 5 сут (в холодильнике).

4) Реагент А. Смешивают равные объемы исходных растворов ТКМ, NaOH, ДСН и воды (можно хранить 2 нед при 20 °С). Небольшой осадок не мешает определению, если перед употреблением хорошо встряхнуть раствор.

5) Реагент Б. Разбавляют водой реагент Фолина — Чикольте (1:5).

Методика. Белок (5—10 мкг) разбавляют водой до конечного объема

1,0 мл. Добавляют 0,1 мл 0,15%-ного ДОХ и оставляют стоять 10 мин при 20 °С. Добавляют 0,1 мл 72%-ной ТХУ. Перемешивают и центрифугируют при 3000 g 15 мин. Жидкость с осадка отделяют декантацией (процедура осаждения может быть опущена, если отсутствуют примеси или в процессе измерения их присутствие учитывается).

К осадку белка добавляют 1 мл воды и 1 мл реагента А. Перемешивают до растворения и оставляют стоять 10 мин при 30 °С. Добавляют 0,5 мл реагента Б, быстро перемешивают. Через 30 мин измеряют поглощение при 750 нм. Уменьшение интенсивности окраски во времени составляет 1—2% в час при 20 °С. Зависимость поглощения от концентрации белка в логарифмических координатах линейна. Метод осаждения белка ТХУ из раствора в дезоксихолате применим как к растворимым, так и к мембранным белкам.

Белок в количестве 1 —10 мкг может быть определен по этой же методике с уменьшением объемов всех реагентов в 5 раз.

8.18.2.3. Другие модификации метода Лоури, приводящие к линейной зависимости.

Метод 1 [144].

Реагенты.

A. 2 г KNa-тартрата и 100 г Nа₂СО₃ растворяют в 500 мл 1,0 М NaOH и разбавляют водой до 1 л.

Б. 2 г KNa-тартрата и 1 г CuSO₄растворяют в 90 мл воды и добавляют 10 мл 1 М NaOH.

Реагенты А и Б пригодны к употреблению в течение 6 месяцев, если хранятся в полиэтиленовых емкостях.

B. Реагент Фолина — Чикольте разбавляют водой (1:15). При титровании 1 м NaOH до pH 10 (по фенолфталеину) раствор должен быть 0,15— 0,18 М по [H⁺], готовится ежедневно.

Методика. Образцы исследуемого белка и белка-стандарта разбавляют водой до 10 мл в пробирке диаметром 13 мм. Добавляют 0,9 мл реагента A, перемешивают и помещают на 10 мин в водяную баню при 50 °С. Охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,1 мл реагента Б, оставляют на 10 мин, затем максимально быстро добавляют 3 мл реагента В и перемешивают в течение 1 с. Нагревают 10 мин при 50°С. Охлаждают и измеряют поглощение при 650 нм (во избежание помутнения раствора кюветы по окончании работы промывают НСl).

Замечание. Поглощение при 650 нм на 30% ниже, чем при 750 нм, но интенсивность окраски выше, чем при использовании оригинального метода Лоури; кроме того, зависимость оптической плотности от количества белка линейна в диапазоне 15—110 мкг. Утверждается, что низкая растворимость некоторых белков не затрудняет анализ. Влияют сахароза и тритон Х-100 (как и в исходной методике).

Метод 2 [156].

Рeагенты.

A. Растворяют 0,2 г тартрата натрия и 10 г Na₂CO₃ в 55 мл 1 М NaOH. Разбавляют дистиллированной водой до 100 мл.

Б. Растворяют 2 г тартрата натрия и 1 г CuSO₄∙5H₂O в 90 мл воды. Добавляют 10 мл 1,0 М NaOH.

B. Разбавляют реагент Фолина—Чикольте дистиллированной водой (1:2). Раствор готовят ежедневно.

Методика. Белок растворяют в 150 мкл воды, приливают 100 мкл 2 М NaOH. Перемешивают на вибраторе и добавляют 180 мкл реагента А. Смешивают, оставляют стоять 30—45 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мкл реагента Б. Смешивают. Оставляют стоять 20 мин или несколько дольше. При интенсивном перемешивании добавляют двумя порциями по 300 мкл реагента В. Выдерживают при комнатной температуре 30—60 мин и измеряют поглощение при 650 или 750 нм. Строят градуировочный график в диапазоне 0—50 мкг белка.

Замечание. В общих случаях градуировочные графики линейны до величины поглощения 1,1 и несколько большей при измерении при 750 нм. Увеличение концентрации реагента В приводит к улучшению результатов. Присутствие ДНС не мешает определению.

8.18.2.4. Метод Лоури. Определение в присутствии детергентов.

Метод 1 [386]. Определение белка возможно в присутствии ДСН и тритона Х-100.

Реагенты.

A. Щелочной раствор меди. 250 мг этилендиаминтетраацетата меди растворяют в 800 мл дистиллированной воды. Добавляют 100 мл 20%-ного Na₂CO₃(масс./об.) и 10 мл 10,0 М NaOH. Перемешивают и разбавляют водой до 1 л.

Б. 10%-ный раствор ДСН.

B. Реагент Фолина — Чикольте (фирма Harleco) разбавляют водой (1:1).

Белок-стандарт. Растворяют 50 мг БСА в 50 мл 0,1 %-ного тритона Х-100. Аликвоты этого раствора разбавляют до концентрации по белку 40, 60, 80, 100 и 120 мкг/0,2 мл.

Методика. Помещают 0,2 мл раствора белка в пробирку и добавляют 1 мл реагента А. Смешивают на вибраторе и оставляют стоять при комнатной температуре 15 мин. Добавляют 1 мл реагента Б. Смешивают, добавляют 0,1 мл реагента В, выдерживают 30 мин, после чего измеряют поглощение при 500 нм.

Замечание. Добавление 10%-ного ДСН обязательно, поскольку ДСН предотвращает образование осадка при приливанин реагента Фолина к образцам, содержащим тритон Х-100. В диапазоне 40—120 мкг зависимость поглощения от количества белка линейна. Допустимое содержание тритона Х-100 в образце составляет <1%, при большей концентрации детергента необходимо добавить соответствующее количество белка-стандарта, чтобы компенсировать образование окраски. Предложено перед определением по методу Лоури удалять тритон Х-100 путем однократной экстракции изоамиловым спиртом [245].

Метод 2 [50].

Методика. Используют те же реагенты, что и в методе 1. Белок разбавляют до объема 0,7 мл. Добавляют 1 мл реагента А. Смешивают и оставляют стоять при комнатной температуре 15 мин. Добавляют 0,5 мл реагента Б, затем 0,1 мл реагента В и быстро перемешивают. Оставляют стоять 30 мин при комнатной температуре, после чего измеряют поглощение при 500 нм. В качестве белка-стандарта используют БСА (0—60 мкг). Как стандарт, так и образец должны содержать одинаковое количество детергента.

Замечание. В присутствии ДСН (до концентрации 4,35%) допустимо наличие других детергентов до 1% (катскам, ионидет-Р40, твин-20) и 0,75% цетилтриметиламмонийбромида.