Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Обсуждение
Количество анализируемого образца
Представительный список исследованных образцов приведен в табл. 17.3. В настоящее время минимальное количество материала, необходимое для получения полезной информации о последовательности, составляет 5—10 пмоль (0,05—0,1 мкг) в случае белка среднего размера и 50 пмоль (0,05 мкг) для короткого пептида. Секвенирование сильно гликозилированных белков, таких, как эритропоэтин (60% углеводов), до сих пор не представляло особых проблем, хотя необходимо увеличивать время отщепления аминокислот, стоящих в цепи как до, так и после гликозилированного остатка, для сведения к минимуму содержания остаточных аминокислот, вызванного неполнотой отщепления предыдущих. Аналогичным образом поступают в случае последовательностей, содержащих пролин, сопровождаемый аминокислотными остатками, имеющими объемные боковые цепи (Lys, Arg, Leu в нейропептиде В из Aplysia).
Пожалуй, наиболее важное преимущество ГФ-секвенатора состоит в том, что, он позволяет анализировать следовые количества полипептидов, выделенных электрофорезом в полиакриламидных гелях в присутствии ДСН и элюированных из окрашенных гелей (антиген клеточной стенки меланомы, мембранный фосфопротеин из Aplysia, интерлейкин II или фактор роста Т-клеток).
Таблица 17.3. Пептиды, анализированные на ГФ-секвенаторе
|
Отношение числа идентифицированных остатков к общему числу остатков |
Количество |
||
|
Анализируемый образец |
пмоль |
мкг |
|
|
Ангиотензин |
8/8 |
500 |
0,5 |
|
Ангиотензин |
6/8 |
50 |
0,05 |
|
Соматостатин |
14/14 |
1400 |
2,0 |
|
В-цепь инсулина |
30/30 |
300 |
1,0 |
|
Нейропептид В из Aplysia |
31/34 |
500 |
2,0 |
|
Динорфин |
14/17 |
20 |
0,04 |
|
Миоглобин |
90/153 |
10 000 |
165 |
|
Миоглобин |
22/153 |
5 |
0,08 |
|
Белок 1 кутикулы личинки дрозофилыа |
55/166 |
850 |
15 |
|
Белок 3 кутикулы личинки дрозофилыа |
36/96 |
900 |
9 |
|
Мембранный фосфопротеин (М 22∙103) из Aplysia б |
23/200 |
15 |
0,3 |
|
Фактор роста Т-клеток человека б |
15/160 |
25 |
1,0 |
|
a-цепь антигена HLA-DR гистосовместимости человека |
49/300 |
700 |
23 |
|
ß-цепь антигена HLA-DR гистосовместимости человека |
39/240 |
500 |
13 |
|
Эритропоэтин человека в |
28/150 |
100 |
1,6 |
|
Антиген поверхности клетки меланомы человека в |
13/850 |
60 |
5,5 |
а Очищен электрофокусированием в ПААГ, содержащем мочевину. Элюирован электрофоретически из ДСН — ПААГ, окрашенного кумасси голубым. в 60% углеводов по массе.