Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Обсуждение
Прогнозы

Сегодня в тех случаях, когда исследуемый белок может быть очищен лишь в следовых количествах, главным ограничением для получения данных об аминокислотном составе и последовательности аминокислот является качество выделенного образца. Во многих случаях, когда выход белка после очистки составляет 10—100 пмоль, существует большое расхождение между количеством материала, определенным по данным аминокислотного анализа, и количеством белка, оцененным по выходу первого ФТГ-производного аминокислоты. Такого различия в оценке содержания анализируемого объекта не наблюдается, когда имеют дело со следовыми количествами белка, взятого из большой навески чистого материала, и оно, вероятнее всего, отражает частичное блокирование N-концевых аминокислот, происходящее при выделении образца. В случае электрофоретического выделения полипептидов в ДСН—ПААГ минорные белковые компоненты можно защитить от окислительных модификаций добавлением восстановителей в наносимые образцы.

Снижение постадийных выходов, связанное с уменьшением количества носимого образца (рис. 17.4), является веским доказательством наличия следовых количеств окислителей в секвенаторе, даже если все реагенты и растворители были тщательно очищены. Предварительные результаты указывают на то, что еще более тонкая очистка всех реактивов и блокирования окислителей добавлением в растворители больших количеств восстанавливающих агентов, таких, как дитиотреит, может улучшить постадийные выходы при нанесении очень малых количеств образца.

Методически наиболее перспективно совместное использование высокой разрешающей способности ДСН—ПААГ-электрофореза и анализа последовательности аминокислот на ГФ-секвенаторе. В настоящее время можно получить частичную аминокислотную последовательность белка, полоска которого при окрашивании кумасси голубым едва видна в геле и который может представлять собой редко экспрессируемый компонент клетки. Данные о частичной аминокислотной последовательности такого белка можно использовать для синтеза олигонуклеотидных праймеров (зондов), необходимых для клонирования кДНК, комплементарной мРНК, с которой транслируется белок [12]. Этот подход уже использовался для клонирования труднодоступных генов интерферонов [5] и антигена гистосовместимости человека [13].

От редактора. Коммерческий прибор (модель 470А фирмы Applied Biosystems) испытывался в процессе микроаналитического определения последовательности. Серийные анализы с использованием 1 нмоль миоглобина после проведения 22 циклов отщепления дали среднее значение начального и постадийного выходов 24,7±4,9% и 96,1 ±1,9%, (n=5) [31. Фирма Applied Biosystems регулярно выпускает Users Bulletin, содержащий много полезной' информации о всех аспектах анализа аминокислотной последовательности белка.