Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Обсуждение
Анализ структуры на микроуровне
С появлением ВЭЖХ и высокочувствительных проточных детекторов стал возможным анализ на микроуровне с идентификацией пикомольных количеств вещества. Чувствительность микроанализа ограничивается чистотой производных, их стабильностью в ходе и после отщепления, наличием примесей. Обязательное условие — высокая чистота растворителей; для устранения возможности загрязнения секвенатор, во-первых, должен иметь минимальные «мертвые» объемы и некорродирующие клапаны и соединения, во-вторых, необходимо постоянно поддерживать на высоком уровне технические параметры прибора. Лимитирующими факторами в жидкофазном анализе является качество полибрена, в твердофазном — качество носителей. Дополнительно осложняет анализ существенное различие выходов отдельных производных. Некоторые тиогидантоины отщепляются с высокими выходами и устойчивы, другие присутствуют в малых количествах, так как они либо плохо отщепляются, либо разрушаются после отщепления; в любом случае их трудно обнаружить па фоне побочных продуктов. Следует тщательно контролировать техническое состояние прибора для того, чтобы быть уверенным в результатах тех анализов, где существует риск подавления полезных сигналов шумами, хотя бы и сведенными к минимуму. Работоспособность самого прибора можно проверить проведением холостого опыта (без пептида или белка). Фракции, полученные с каждого цикла опытов, следует проверять на наличие загрязнений, используя для анализа большие аликвоты фракции. Для построения градуировочного графика прибора выполняют контрольные анализы на стандартных образцах пептидов или белков. Следует отметить, что методы выделения, используемые для очистки пептидов и белков, сильно влияют на растворимость объектов, т. е. они имеют большое значение при оценке самой возможности анализа их структуры методом Эдмана. Следы солей буферов (например, ацетат аммония) или аминов снижают эффективность отщепления ФТГ-производных аминокислот и вызывают частичное блокирование N-концевых аминокислот пептидов. Это обстоятельство оказывается решающим при анализе очень малых количеств пептидов; для предотвращения необратимого блокирования N-концевых аминокислот выделение пептидов (белков) следует проводить в восстанавливающих условиях.
12.6.4.1. Отщепление по Эдману с применением меченого реагента. В литературе описано несколько методик, использование которых может существенно снизить расход образца. В одной из таких методик применяется радиоактивно меченный ФИТЦ [6, 8, 9, 27]. Следует работать только с чистым реагентом, так как примеси, присутствующие в исходном ФИТЦ, а также образующиеся в ходе отщепления, делают идентификацию ФТГ-производных аминокислот ненадежной. Уровень радиоактивного фона зависит также от того, насколько плотно подтянуты уплотнения клапанов и резьбовые соединения. Гораздо чище проходит анализ структуры пептидов и белков, меченных in vivo. Трудности, связанные с использованием метки в белках или реагентах, обсуждаются в работе [44].
12.6.4.2. Анализ с использованием ДАБИТЦ. Описан эффективный подход к ручному определению последовательности на микроуровне, при котором ФИТЦ заменен его аналогом
4-N,N-диметиламиноазобензолизотиоцианатом (ДАБИТЦ) [12]. Метод очень чувствителен — производные аминокислот можно легко идентифицировать на пикомольном уровне при помощи ТСХ и анализировать количественно методом ВЭЖХ [13, 37]. Подробно методики изложены в гл. 14. Для твердофазного анализа на микроуровне разработан метод совместного использования ФИТЦ и ДАБИТЦ [25]. Недавно предложен улучшенный вариант этого метода, дающий однозначные результаты при работе с очень малыми количествами образца [52]. Благодарности. Я благодарю А. Лехмана за содействие в подготовке этой главы, а также К. Ашман и П. Ролинга за предварительное ознакомление с материалом после перевода его на английский язык.