Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Методы присоединения
Присоединение по карбоксилу при помощи карбодиимида

С-концевой карбоксил пептида активируется водорастворимым карбодиимидом и ковалентно связывается с аминополистиролом и аминопропилстеклом (а также с ß-АПС).

Ранее проводили активацию пептидов, защищенных по N-концевой аминокислоте, в безводных щелочных условиях, используя ТЭТА-смолу и проводя реакцию при 40—50 °С [48]. В настоящее время используют незащищенные пептиды, а саму активацию проводят в более мягких условиях во избежании нежелательных реакций карбоксильных групп белковых цепей [3, 36, 49, 50, 72, 76]. Было найдено, что при использовании аминополистирола присоединение при pH 3—5 предпочтительнее конденсации в щелочных условиях. Напротив, носители на основе стекла лучше применять в безводных условиях [52, 60]. Кроме того, предложено совместное использование присоединения по карбоксильным группам пептида и по остаткам Lys [54, 55].

12.4.4.1. Достоинства, ограничения, методика присоединения.

Достоинства.

1. Присоединение по карбоксилу можно применять почти по всем типам пептидов, включая аргинил- и лизилсодержащие фрагменты триптических гидролизатов.

2. Конденсация в кислых условиях удобна во многих случаях, особенно тогда, когда лизилсодержащие пептиды нерастворимы в щелочных условиях, используемых в ДИТЦ-методе.

3. При наличии в пептиде внутренних остатков Lys с неизвестным расположением в цепи присоединение этого фрагмента по С-концу является предпочтительным.

4. Метод может быть использован для изучения аминокислотной последовательности на микроуровне.

Ограничения.

1. Для небольших пептидов конденсация проходит с выходом 40—70% [52]; при наличии С-концевого Lys выходы малы.

2. Пептиды, содержащие более 30 аминокислот, и белки часто присоединяются с выходами до 80—90%. Например, для брадикинина и В-цепи инсулина выходы составили 70—75 и — 60% соответственно [73]. В случае белков эффективность конденсации может достичь 90%. Однако чем лучше идет присоединение белков к носителю, тем хуже они вступают в реакцию Эдмана (возможно, из-за стерических препятствий). Поэтому следует избегать количественного присоединения белка по всем СООН-группам. Мы нашли, что лучше всего, когда выход составляет 10—30% теоретического, с преимущественным присоединением по С-концевому карбоксилу. Однако для белков наилучшие результаты определения последовательности получены при использовании ДИТЦ-метода [37].

Методика 1. Присоединение к аминополистиролу.

Отмывка смолы. К 30—50 мг аминополистирола добавляют 1 мл буфера № 2 (разд. 12.2.5), суспензию перемешивают до появления фиолетовой окраски раствора. Смолу промывают водой (2 раза по 8 мл), ДМФЛ (2 раза по 1 мл), центрифугируют.

Присоединение. Высушивают раствор пептида в вакууме. Образец должен быть свободен от соли и органических кислот (например, уксусной, муравьиной). 5—50 нмоль пептида растворяют (под азотом) в 50 мкл буфера № 2. Отбирают пробу на проверку полноты растворения. Добавляют раствор пептида к предварительно отмытой смоле. Пробирку, содержащую пептид, ополаскивают 200 мкл ДМФА и добавляют промывки к реакционной смеси. Ополаскивание пробирки повторяют (100 мкл ДМФА). Добавляют под азотом свежеприготовленный раствор 2 мг карбодиимида в смеси 20 мкл воды и 80 мкл ДМФА. Перемешивают 60—120 мин при 30 °С (при работе с Glx- и Asx-содержащими пептидами время конденсации составляет 30—60 мин). Реакционную смесь центрифугируют; жидкость над осадком контролируют на содержание несвязанного пептида. Смолу промывают ДМФА, метанолом, буфером I (2 раза по 200 мкл).

Насыщение свободных аминогрупп. Добавляют под азотом к пептидилполимеру 200 мкл буфера № 1, затем 200 мкл раствора № 1, содержащего ФИТЦ (разд. 12.2.6). Аккуратно перемешивают 30 мин при 30 °С. Смолу промывают ДМФА (2 раза по 200 мкл), метанолом (2 раза по 200 мкл), центрифугируют, сушат в вакууме.

Методика 2. Присоединение к аминопропилстеклу.

Подготовка пептида. 5—50 нмоль образца сушат в вакууме. Растворяют в 50— 100 мкл безводной ТФУ, выдерживают под азотом при комнатной температуре в течение 15 мин. Немедленно сушат в вакууме над таблетками КОН (сушить не более 15 мин, более продолжительное высушивание может сделать образец нерастворимым).

Отмывка носителя. Носитель (взятый в соотношении 1 мг/нмоль пептида) промывают ДМФА (4 раза по 2 мл/50 мг стекла).

Присоединение. К высушенному пептиду приливают свежеприготовленный раствор карбодиимида (2 мг в 200 мкл ДМФА). Озвучивают смесь в течение 1 мин. Добавляют ,50 мг аминопропилстекла и деаэрируют. Выдерживают под азотом (при аккуратном перемешивании) при 40 °С в течение 60 мин. Центрифугируют. Жидкость над осадком контролируют па содержание несвязанного пептида. Пептидилстекло промывают ДМФА и метанолом (2 раза по 200 мкл). Центрифугируют, сушат в вакууме.