Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Методы присоединения
Контроль степени присоединения

12.4.5.1. Проба на растворимость. Пептиды обычно проверяют на растворимость в буфере, используемом для присоединения. Пептид растворяют в буфере, отбирают аликвоту, содержащую 2 нмоль образца, высушивают пробу в вакууме или сразу же наносят на пластинку ТСХ (целлюлоза Cell 300, фирма Macherey and Nagel). Хроматографируют в системе: пиридин — бутанол — уксусная кислота — вода (10:15:3:12, по объему). Опрыскивают пластинку раствором нингидрина в ацетоне (3 г на 100 мл). Должно проявиться только одно пятно с интенсивностью окрашивания, соответствующей 2 нмоль пептида. Если объем пробы превышает 2,5 мкл, то следует удалить соли лиофилизацией. При анализе структуры на макроуровне для экономии материала такой тест следует проводить более чувствительными методами, например методами ВЭЖХ или аминокислотного анализа.

12.4.5,2. Контроль степени присоединения. По окончании реакции конденсации жидкость над осадком проверяют па содержание остаточного (неприсоединенного) пептида. Отобранную пробу подвергают гидролизу и проводят аминокислотный анализ. При наличии пептида в растворе присоединение повторяют при других условиях. Если располагают достаточным количеством образца, то после обессоливания образец вновь используют в реакции конденсации.

Определение выхода в реакции присоединения. Порцию пептидилсмолы или стекла (10 мг) промывают ТФУ (2 раза по 0,5 мл) для удаления нековалентно связанного пептида, сушат в вакууме. Смолу смешивают с 250 мкл раствора состава: 12 М соляная кислота— пропионовая кислота (1:1), помещают в ампулы, вакуумируют и выдерживают в течение 24—48 ч при 110 °С [57] или 2 ч при 130 °С (в ампулах под азотом) [65]. Затем частицы смолы отделяют фильтрованием, отбрасывают, раствор упаривают, сухой остаток растворяют в нитратном буфере для аминокислотного анализа (pH 2,2). Проводят аминокислотный анализ и рассчитывают выход аминокислот. Гидролиз пептидилполимера можно проводить и в смеси 12 М соляная кислота — уксусная кислота — фенол (2:1:1) под вакуумом в течение 24 ч при 110 °С [20].

Пробные анализы на секвенаторе. Рабочий режим прибора и чистоту используемых реактивов и растворителей можно проверить, используя в качестве стандартных образцов брадикинин или В-цепь инсулина (в конденсацию вводят 10—100 нмоль образца) [78].