Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение аминокислотной последовательности с использованием 4-диметиламиноазобензол-4'-изоцианата (в ручном варианте)
Идентификация ДАБТГ-аминокислот
Тонкослойная хроматография

Все ДАБТГ-аминокислоты, кроме Ilе и Leu, идентифицируют тонкослойной хроматографией на полиамидных пластинках (25X25 мм). Образцы наносят в угол пластинки на расстоянии 6 мм от прилегающих сторон с помощью микропипетки на 1 мкл (H. Е. Pederson) с тонким, тщательно отшлифованным сферическим кончиком. Диаметр пятна не должен превышать 1 мм, при нанесении пользуются феном с холодным воздухом. Двумерную хроматографию проводят в закрытых камерах (30X80X80 мм) в восходящем потоке растворителя. Насыщение фазами необязательно. Растворитель 1 (в первом направлении): вода — уксусная кислота (2:1), растворитель 2 (во втором направлении): толуол — н-гексан — уксусная кислота (2:1:1).

РИС. 14,3. Разделение на полиамиде ДАБТГ-производных аминокислот и побочных продуктов реакции.

Растворитель 1: вода — уксусная кислота (2:1); растворитель 2: толуол — н-гексан — уксусная кислота (2:1:1). ДАБТГ-производные обозначения однобуквенным кодом для соответствующих аминокислот. Темные пятна — пятна производных, окрашенные в красный цвет; обведенные точками пятна — в голубой, заштрихованные — в оранжевый, е — ДАБТК-производное диэтиламина; U — побочные продукты разложения избытка реагента. Подробно о ДАБТГ-производных серина, треонина, лизина см. работу [3].

Разделение производных Ilе и Leu достигается одномерной хроматографией на пластинках с силикагелем в системе хлороформ — этанол (100:3) [9]. После высушивания пластинку помещают в пары НСl, при этом желтые пятна превращаются в красные или голубые (рис. 14.3). Успешная идентификация ДАБТГ-производных аминокислот в значительной степени зависит от искусства экспериментатора в проведении хроматографии и интерпретации полученных результатов [2, 10].

РИС. 14.4. Разделение смеси ДАБТГ-производных аминокислот (5 пмоль каждого) методом ВЭЖХ на колонке Zorbax ODC. Условия хроматографии: растворитель А — 35 мМ ацетатный буфер (pH 5,0), растворитель Б — ацетонитрил. Градиент от 45 до 70% буфера Б в течение временного интервала 0 — 10 мин; 70% Б 10—12 мин; 70—80% Б 12—14 мин; 80% Б 14—22 мин; 80 — 45% Б 22—25 мин. Температура колонки 22 °С. Скорость ленты самописца 40 см/ч. Детекция при 436 нм, шкала — 0,005 опт. ед.

Необходима большая практика для того, чтобы корректно идентифицировать производные таких аминокислот, как серин, треонин и лизин, каждое из которых дает на хроматограмме несколько пятен [3, 10].