Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия
Электронная микроскопия
Молекулярная микроскопия

Технические средства, используемые в трехмерной электронной микроскопии «окрашенных» образцов, могут быть применены и к «неокрашенным» объектам для исследования с более высоким разрешением. Теоретически это предполагает возможность прямого визуального наблюдения образующих молекулу атомов. Такое исследование «неокрашенных» образцов было проведено [7, 15]. однако для этого пришлось разработать специальные методы микроскопирования и значительно более сложные методы обработки изображений на ЭВМ. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, образец должен быть предохранен от дегидратации в вакууме микроскопа заливкой в топкую пленку сахарозы. Во-вторых, «неокрашенный» образец не защищен от повреждений контрастирующим веществом и, следовательно, время его облучения электронами должно быть столь коротким, чтобы радиационное разрушение было минимальным. В действительности это время настолько мало, что получаемые изображения обладают чрезвычайно низким контрастом. Поэтому информация о структуре может быть получена только для упорядоченных двумерных кристаллов.

Необходимость специальных методов обработки изображений обусловлена тем, что объект состоит из легких атомов, не окрашенных солями тяжелых металлов «красителя». В этом случае основной вклад в формирование изображения вносит не поглощение электронов атомами образца, а их торможение, изменяющее фазы электронов. Поэтому точно сфокусированное изображение в случае «неокрашенных» образцов не содержит структурной информации. Для визуального наблюдения легких атомов необходимо сделать серию снимков с различной фокусировкой, для того чтобы с помощью анализа на ЭВМ можно было выбрать фазово-контрастные изображения, отображающие взаимное расположение легких атомов.

Для реконструкции трехмерной структуры приходится объединять информацию из многих микрофотографий. Необходимо, чтобы в каждой из них отношение величин полезного сигнала и шума было достаточно велико, что возможно только в случае высокоупорядоченных периодических структур. Именно поэтому исследование с высоким разрешением может быть выполнено только для таких объектов.