Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Дисульфидные связи
Определение числа дисульфидных связей
Число дисульфидных связей определяют по содержанию в белке остатков карбоксиметилцистеина, т. е. по аминокислотному составу белка до и после его полного восстановления и карбоксиметилирования. В случае многоцепочечных белков для получения дополнительной информации о распределении дисульфидных связей их фракционируют на составляющие полипептидные цепи. Остатки полуцистина определяют по содержанию метки после восстановления и последующего алкилирования радиоактивно меченными SH-реагентами. Удовлетворительные результаты получают при применении [14С] иодоацетамида (1,2 мкКи/мкмоль) и [14С]иодоуксусной кислоты (0,5 мкКи/мкмоль) [19, 31].
Содержание дисульфидных групп в белке можно определить спектрофотометрически или флуориметрически. Наиболее распространена методика, основанная на спектрофотометрическом определении дисульфидных групп с помощью реактива Эллмана [14]. В работе [29] с помощью этой методики определяли число внутри- и межцепочечных связей в человеческом иммуноглобулине IgM. Восстановленный (или нативный) белок осаждали на холоду 5%-ной трихлороуксусной кислотой (ТХУ), осадок отделяли центрифугированием и пятикратно промывали раствором ТХУ для удаления восстановителя. Затем осадок растворяли в небольшом объеме 5 М гуанидина, раствор осветляли центрифугированием, концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм. К аликвотной части раствора белка добавляли равный объем 0,1 м трис-НСl (pH 9,1), содержащего 5 М гуанидин, 2Х10-4М 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную) кислоту (ДТНБ); pH реакционной смеси 8,1. Содержание сульфгидрильных групп рассчитывали по поглощению при 412 нм и коэффициенту молярной экстинкции 2-нитро-5-бензоата (ε = 13 600). Дисульфидные группы определяют также по тушению флуоресценции флуоресцeинмеркуриацетата [26].