Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Определение белка с тринитробензолсульфокислотой в присутствии липидов

Реагенты.

5%-ный раствор ДСН (масс./об.) в воде.

2,4,6-Тринитробензосульфокислота (ТНБС) (фирма Eastman, белая маркировка) может быть перекристаллирована из 1 М НСl. Готовят 0,03 М раствор в смеси трет-бутанол — втор-бутанол (9:1). Раствор можно хранить 2 мес при 0—2 °С.

Хлороформ или диэтиловый эфир.

Муравьиная кислота 98%.

Методика. Образец белка (0,04—0,5 мкг) обрабатывают 20 мкл 5%-ного ДСН и высушивают в потоке газа (N₂, СO₂ или воздух). Добавляют 1 мл 0,1 М калийтетрабората и перемешивают в вибраторе. Приливают 0,2 мл раствора ТНБС и снова перемешивают. Выдерживают 30 мин при 24—26 °С (10 мин при 40°С), периодически встряхивая (можно использовать вибратор). Добавляют 3 мл хлороформа или диэтилового эфира, немедленно смешивают и центрифугируют 1 мин при 1000 g. Органическую фазу, содержащую липиды и другие примеси, отбрасывают. Подкисляют водную фазу 0,2 мл НСl. Повторно экстрагируют 3 мл хлороформа или эфира и отбрасывают органическую фазу. Добавляют 2,0 мл 98%-ной муравьиной кислоты и нагревают при 100 °С 20 мин. По охлаждении окрашенного в желтый цвет раствора измеряют оптическую плотность при 345 нм.

Замечание. Стандартами служат овальбумин или БСА. Ошибка определения ~10%. Другие методики определения белка в присутствии липидов не дают достоверных результатов. Аналогичный метод был разработан для определения аминов, аминокислот, белков в смеси [257] и свободных аминогрупп в белках [136]. Реакция аминокислот и пептидов с ТНБС использовалась для их детекции при ВЭЖХ [381].