Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Определение белка, присоединенного к твердому носителю
Белок, связанный с матрицей

В аффинной хроматографии и твердофазном секвенсировании часто бывает необходимо определить количество белка, связанного с инертной матрицей, такой, как агароза, декстраны и целлюлоза. В принципе это может быть сделано гидролизом образца с последующим определением общего азота, но в матрицу может быть включен небелковый азот, например когда используется активация с помощью BrCN или вводится N-содержащая «вставка». Количественный аминокислотный анализ образца белок — матрица часто бывает неудовлетворительным из-за наложения фона высокой концентрации отщепленных углеводов. В альтернативном варианте проводят дифференциальный количественный анализ белка, добавленного к матрице и оставшегося (после интенсивных промывок), не связавшегося белка. Однако существуют методы, позволяющие быстро проводить прямое количественное определение иммобилизованного белка. Они описываются ниже (см. также разд. 12.3.3).

Современная модификация метода [240, 398]. К связанному с носителем белку добавляется известное количество Сu²⁺. Количество ионов меди, образовавших комплекс с белком, адекватно количеству иммобилизованного белка. Определяется оно измерением свободных ионов меди по реакции с диэтилдитиокарбаматом.

Реагенты.

A. 0,167 М NaOH, содержащий 3,4 г/л тетрагидрата KNa-тартрата.

Б. К 590 мл реагента А добавляют 10 мл 0,2 М CuSO₄.

B. Диэтилдитиокарбамат натрия (0,1 г) растворяют в 100 мл 0,025%-ного раствора кристаллического БСА.

Г. Суспензия в деионизованной воде смолы AGI-X8 (фирмы Bio-Rad; 200—400 меш, в хлоридной форме) (200 мг/мл).

Методика. Смолу с иммобилизованным белком тщательно промывают для удаления солей и свободного белка. Пробу смолы центрифугируют 3 мин при 300 g и измеряют объем осадка. Добавляют деионизованную воду в соотношении 1:1 до 1:4 в зависимости от количества связанного белка до получения тестообразной массы. Берут часть этой массы (0,01—0,10 мл) и переносят в пробирку. Разбавляют дистиллированной водой до 1,5 мл. Добавляют 1 мл смеси реагентов (3—6 мл реагента Б, разбавленного до 10 мл реагентом А). Перемешивают. После 15 мин стояния при комнатной температуре приливают 5 мл реагента В. Перемешивают и центрифугируют при низкой скорости. Измеряют поглощение при 446 или 486 нм окрашенной в темно-желтый цвет жидкости над осадком против кюветы с водой. С образцом необработанной смолы проводят контрольные измерения.

Градуировочный график. К 0,5 мл серии растворов, содержащих 50—800 мкг белка-стандарта, добавляют 1 мл реагента Б. Смешивают и через 15 мин добавляют 1 мл смолы и 5 мл реагента В. Центрифугируют и измеряют поглощение, как описано выше.