Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Получение мономеров с целью секвенирования
Техника работы с липопротеинами

Апопротеины обычно готовят из липопротеинов путем экстракции липидов органическими растворителями (этанолом, смесями эфир — этанол, метанол — хлороформ), однако некоторые апопротеины частично растворимы в органических растворителях. Сывороточные липопротеины содержат фракцию низкомолекулярных пептидов, растворимых в этаноле и в меньшей степени в смеси этанол — эфир, тогда как высокомолекулярные липопротеины нерастворимы в органических растворителях [157]. Растворимость апопротеинов в органических растворителях уменьшается при понижении температуры. Имеются данные, что некоторые мембранные белки включают ковалентно связанные липиды [159].

1.6.3.1. Методики.

Экстракция липопротеинов низкой плотности [157]. Экстракцию проводят при —10 °С. Раствор белка (2—5 мг/мл) диализуют против 0,15 М NaCl, содержащего 1 мМ ЭДТА, а затем по каплям прибавляют к 50 мл смеси эфир — 95%-ный этанол (1:3) в круглодонной центрифужной пробирке на 50 мл. Экстракцию проводят в течение 2 ч при медленном вращении пробирки (15 об./мин). В заключение осадок отделяют центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин. Повторную экстракцию проводят аналогичным образом. В заключение осадок трижды промывают эфиром и высушивают в атмосфере азота. Для регенерации белка, частично перешедшего в органический растворитель, первый экстракт разбавляют эфиром (до соотношения этанол : эфир=3 : 5) и выдерживают при —10 °С в течение 12 ч.

Экстракция липопротеинов желтка куриного яйца [30]. Раствор липопротеина в 1 М NaCl (~6% масс./об.) диализуют несколько раз против 6 М мочевины+0,05 М НСl (pH 3,3) при 20 °С до почти исчерпывающего удаления NaCl. С целью ускорения обессоливания можно провести предварительный диализ против дистиллированной воды. К полученному раствору (17 мл) добавляют смесь хлороформ — метанол (20 мл+40 мл) и гомогенный раствор инкубируют при 20—25 °С в течение 30 мин, после чего добавляют 20 мл хлороформа. Нижний слой отбрасывают, верхний слой вторично экстрагируют 10 мл хлороформа. В случае необходимости эмульсию центрифугируют. Слой хлороформа отбрасывают, водный слой выдерживают при 20 °С в течение 20 ч, а затем диализуют против 6 М мочевины.