Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Концентрирование растворов белков

Для концентрирования белков из разбавленных растворов применяется осаждение солями, кислотами и органическими растворителями (ацетон, метанол), ультрафильтрация, диализ, выпаривание, лиофилизация. Осуществлять эти операции тем сложнее, чем меньшее количество белка находится в растворе, например трихлороуксусная кислота не осаждает белок при его содержании 1—25 мкг [17].

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка на мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [³Н]-1-фторо-2,4-динитробензола [280]. Для «снятия» белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметилдeкстран [367].

Наиболее распространена как метод концентрирования растворов белков лиофилизация. При интенсивном охлаждении (ацетон, этанол или изопропанол в смеси с твердой углекислотой) раствор замораживают и удаляют воду и летучие буферы в вакууме масляного насоса, снабженного специальной ловушкой. Ловушка заполняется щелочью, если упариваются кислые растворы; концентрированная муравьиная кислота перед замораживанием должна быть разбавлена водой до 30%-ной концентрации.

Для быстрого удаления воды, органических растворителей и летучих буферов может быть использован специальный концентратор фирмы Savant (Speed-Vae Concentrator), в котором упаривание происходит под вакуумом в низкоскоростной центрифуге с контролируемым температурным режимом. В наборе имеются центрифужные пробирки разного объема. Метод особенно удобен для концентрирования фракций с хроматографических колонок или секвенатора, он быстрее и удобнее, чем упаривание отдельных образцов в потоке азота.

Осадки белков, полученные после экстракции неполярными растворителями или в результате высушивания при высокой температуре, могут быть трудно растворимыми. Если белок находится в виде тонкой пленки, то для его растворения используют 1 М NaOH [1 ч, комнатная температура или 10-минутное (и более) нагревание до 100 °С].

Эффективны как растворители белка водный гексафтороацетон [48, 82] и трифтороуксусная кислота [236]. Структурированные белки типа коллагена и кератина после обработки Н₂О₂ легко растворимы в 0,05%-ном ДСН в IMNaOH при 100°С (что используется при определении концентрации этих белков с помощью биуретовой реакции) [130].

При высушивании в высоком вакууме замороженных растворов, содержащих микроколичества свободных аминокислот, коротких пептидов или других низкомолекулярных соединений, существует опасность значительных потерь вещества, приводящая к невозможности количественной оценки процесса в целом. Например, было обнаружено, что за 90 мин лиофилизации при вакууме 5—10 мм рт. ст. (охлаждение смесью QH₅OH+твердый СО₂) терялось 89% 2-[¹⁴С]-L-фенилаланина и 86% N-ферулоилглицил-L-фенилаланина [378].

Для удаления нелетучих буферов, солей, надмуравьиной кислоты и других компонентов растворов белков используют диализ в диализных трубках (типа Visking). В распоряжении исследователей имеется также широкий набор коммерчески доступных целлюлозных фильтров, рассчитанных на диапазон молекулярных масс от 1000 до 50 000 (Spectrapor membrane, фирма Spectrum Medical Industries Inc.) Растворы белков могут быть сконцентрированы в аппаратах для ультрафильтрации. Следует иметь в виду, что существует вероятность потери белков в диализных трубках в результате адсорбции.

Для концентрации пептидов, растворенных в больших объемах натрийацетатного буфера (pH 7,5), содержащего 4 М мочевину, используют колонки с обращенной фазой типа Lichrosorb C8. Контроль элюата, содержащего соли уксусной и муравьиной кислот, обычно осуществляют с помощью флуоресцентного детектора. Быстрое обессоливание от мочевины и буферных компонентов достигается с помощью мини-колонок [278] или специальных патронов фирмы Waters [16, 392] (см. также разд. 6.2.3).

Микроконденсатор, снабженный мембраной Centricon с малой адсорбционной способностью, позволяет быстро (30— 60 мин) концентрировать небольшие объемы (2 мл) до 25— 40 мкл в центрифуге с фиксированным угловым ротором. Обессоливание или замена буфера могут быть проведены одновременно с концентрированием (фирма Amicon — Scientific Systems Division).

Поскольку ДСН является денатурирующим агентом, часто возникает необходимость его полного удаления. Использование для этих целей электрофореза и анионообменной хроматографии приводит к низкому выходу белка. Рекомендовано проводить удаление ДСН путем так называемой ионопарной экстракции с помощью триэтил- или трибутиламмония, дающей высокие выходы (70—100%) в диапазоне от микрограммовых до миллиграммовых количеств белка [153].